Bmp/Smad 信號通路及其在哺乳動物卵巢發育中的作用

文禹粱，馬 琳，趙生國，儲明星*

（1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅蘭州 730070）

骨形態發生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs）作為轉化生長因子-β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族最大的一個亞家族[1]，于1979 年由Urist 等發現，它們可以使未分化的間充質細胞定向分化為骨細胞，并鈣化成骨組織，由此得名為骨形態發生蛋白[2]。BMPs 在動物體內廣泛分布，依靠卵巢功能性的旁分泌/自分泌調節體系，對哺乳動物早期胚胎發育、卵巢顆粒細胞增殖、生殖激素的合成和分泌以及卵母細胞成熟起重要調節作用，而BMPs 主要依賴于經典的Bmp/Smad 信號通路來發揮生物學效應[3-5]。本文對Bmp/Smad 信號通路的成員的表達以及在哺乳動物卵巢發育中發揮的功能進行總結，以期為今后更加深入地研究其調控機制提供參考。

1 Bmp/Smad 信號通路

Bmp/Smad 信號通路由細胞外配體、細胞表面特異受體以及細胞內SMAD 信號分子三大部分共同構成。在Bmp/Smad 信號通路中，在細胞內合成的配體成熟蛋白，以旁分泌/自分泌形式胞吐，再形成同源/異源二聚體，陸續激活BMPR Ⅱ型、Ⅰ型受體。活化的Ⅰ型受體將細胞質內R-SMADs 磷酸化，與Co-SMAD 即SMAD4 結合形成SMAD 蛋白異聚體復合物，進入細胞核與靶基因結合，發揮轉錄調控作用[6]。轉導過程見圖1。

1.1 Bmp/Smad 信號通路中的配體 Bmp/Smad 信號通路中的配體由許多結構高度保守且功能不同的分泌肽組成，截至目前發現的有BMP1（mTLD）、BMP2（BMP2A）、BMP3（Osteogenin）、BMP3B（GDF10）、BMP4（BMP2B）、BMP5、BMP6（Vgr1）、BMP7（OP1）、BMP8a（OP2）、BMP8b、BMP9、BMP10、BMP11（GDF11）、BMP12（GDF7，CDMP3）、BMP13（GDF6，CDMP2）、BMP14（GDF5，CDMP1）、BMP15（GDF9B）、BMP16、GDF3（Vgr2）、GDF15（PLAB，PDF） 以及MIS（AMH）等超過25 種成員，除了BMP1，其他成員均屬于TGF-β 超家族[3]（表1）。BMPs 具有廣泛的生物學效應，在哺乳動物早期胚胎發育、細胞外基質的合成以及調控綿羊排卵數以及產羔數等方面發揮著重要作用[8-10]。

圖1 Bmp/Smad 信號通路[7]

表1 Bmp/Smad 信號轉導通路中的配體、受體以及SMAD 信號分子[11-14]

1.2 Bmp/Smad 信號通路中的受體 BMP 受體（Bone Morphogenetic Protein Receptor，BMPR）為膜蛋白受體，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，屬于TGF-β 超家族成員。截至目前為止共發現I 型和II 型2 種BMP 受體。I 型受體包括ActR I A（ALK2）、BMPR I A（ALK3）以及BMPR I B（ALK6），II 型受體包括BMPR II、ActR II A 以及ActR II B（表1）。I 型和II 型受體分別為55 ku 和70 ku 的糖蛋白，它們的胞外區域含有約150 個氨基酸，I 型受體具有獨特的GS（富含甘氨酸和絲氨酸的序列）結構域，該結構域含有序列SGSGS，位于激酶結構域之前30 個氨基酸的細胞內區域。在Bmp/Smad 信號轉導過程中，BMPs 特異性配體和II 型受體結合形成配體-II 型受體復合物，再與I 型受體結合形成異型低聚體復合物。這時I 型受體高度保守的N端富含絲氨酸/蘇氨酸的激酶區被II 型受體的激酶作用發生磷酸化后被活化[15]。

1.3 Bmp/Smad 信號通路中的Smad 信號分子 在I 型受體活化后可捕獲R-SMADs，使R-SMADs C 末端磷酸化，導致R-SMADs 被SMAD4 上袋狀結構識別并進入細胞核與DNA 結合而識別目的基因發揮生物活性[16]。SMADs 蛋白在Bmp/Smad 信號通路起著重要銜接作用，由約500 個氨基酸殘基組成[17]。1995年，在果蠅中首次發現BMP 同源物（dpp）的信號轉導因子，Raftery 和Sekelsky 將它們分別命名為Mad和Medea[18-19]。1996 年，線蟲II 型受體Daf-4 所識別的SMA/2/3/4 被Savage 等[20]克隆出來。由 于Mad、Sma 以及其他隨后發現的具有獨特的N 和C 端結構域同源物均為TGF-β 超家族信號轉導所必需，所以SMA 和MAD 2 個單詞被Derynck 等[21]結合命名為SMAD。迄今為止已發現9 種脊椎動物SMAD 蛋白，根據結構和功能特點分為3 類：①受體激活型SMAD蛋白（Receptor Activated Smads，R-SMADs），包括SMAD1/2/3/5/8/9，它們是I 型受體激酶的底物，具有通路特異性，其中SMAD1/5/8 受BMP I 型受體的激活；SMAD2/3 受TGF-β 和activin II 型受體的激活。②通用調節性SMAD 蛋白（Common Mediator Smad，Co-SMAD），它通過與R-SMADs 的結合形成異源復合物，隨后移位入核參與信號傳遞，在哺乳動物中Co-SMAD只有1 種，即SMAD4[22]。③抑制型SMAD 蛋白（Inhibitory Smads，I-SMADs），包括SMAD6 和SMAD7。它們以不同方式抑制Smads 的信號傳導功能[23]。

2 Bmp/Smad 信號通路配體、受體以及SMAD 信號分子的表達及其在卵巢發育中的作用

2.1 Bmp/Smad 信號通路中配體的表達以及在卵巢發育中的作用 自發現BMP 家族成員在卵巢細胞中表達以來，越來越多的研究證實了Bmp/Smad 信號通路在哺乳動物生殖活動中的重要性[24]。在綿羊卵巢中，Canty-Laird 等[10]利用免疫組化的方法對BMP1 進行定位，結果顯示，BMP1 存在卵泡發育所有階段的顆粒細胞中，并且調節細胞外基質（ECM）的形成。Erickson 等[25]在小鼠卵巢原發性、繼發性以及竇狀卵泡顆粒細胞中檢測到了BMP2 mRNA 的表達。在人卵丘細胞中，Demiray等[26]檢測到BMP2 mRNA 的表達，并認為BMP2 的表達可作為檢測卵母細胞以及胚胎質量的指標。Ying等[27]研究認為，內胚層衍生物BMP2 和外胚層衍生物BMP4 協作可刺激小鼠原始生殖細胞（Primordial Germ Cells，PGCs）生成。

1999 年，Shimasaki 等[28]認為BMP4 是格拉夫卵泡發育中的黃體化抑制因子。研究表明，BMP4 為綿羊生殖所必需，具有調節動物卵泡的發育、促進顆粒細胞增殖、卵丘擴散以及促進卵母細胞成熟和排卵等功能[29]。Tan 等[9]研究發現，BMP4 可促進卵泡發育，在小鼠體內或者體外添加都可以促進初級卵泡轉化為次級卵泡。又有研究表明，BMP4 基因可誘導增加顆粒細胞對促卵泡激素（FSH）敏感性，調控FSH 依賴的雌激素和孕酮合成[28]。本團隊前期研究發現[30]，小尾寒羊BMP4 基因外顯子3 第305 位堿基發生C/A 突變，該突變的BB 型小尾寒羊平均產羔數比AB 型和AA 型多0.61 只，與小尾寒羊產羔數呈加性效應。在大鼠卵巢中，Pierrer 等[31]通過原位雜交方法對BMP5 的表達模式進行研究，發現BMP5 主要表達于小型至大型竇狀卵泡的顆粒細胞以及卵丘細胞中，并且BMP5 對孕酮生成有明顯的劑量依賴性抑制作用。BMP6 mRNA 在小鼠、綿羊、牛以及山羊卵母細胞中表達[25-32]。Lee 等[33]研究發現，BMP7 可促進原始卵泡的募集，并且BMP7 抑制孕酮的產生可能與排卵機制相關，另外BMP7 在小鼠體內或體外添加均有利于雌二醇增加[34]。BMP15 又稱為GDF9B，已經被確定為影響綿羊產羔數的主效基因，其在綿羊、小鼠、人以及牛的卵子發生和卵泡發育過程中扮演著重要的角色[36-39]。研究表明，BMP15 對動物卵泡發育、卵巢顆粒細胞的增殖、卵丘的擴展、卵母細胞的成熟和排卵等方面均發揮著重要調控作用[29,38-40]。Zhai 等[41]在豬卵丘卵母細胞復合體體外實驗中發現，添加BMP15 可抑制卵丘細胞凋亡。Muralidharan 等[42]在水牛卵丘卵母細胞復合體體外培養實驗中發現，BMP15 的表達與卵丘細胞的擴散程度密切相關。但是BMP15 在不同物種中的表達模式可能存在差異，Passos 等[38]在牛腔前卵泡體外培養實驗中發現，添加BMP15 可上調FSHR 的表達。但是Otsuka 等[43]在體外培養大鼠顆粒細胞實驗中發現，BMP15 可降低FSH 對顆粒細胞的刺激作用，延長細胞黃體化時間。關于其具體的表達模式需要進一步的研究證實。

2.2 Bmp/Smad 信號通路中受體以及SMAD 信號分子的表達及其在卵巢發育中的作用 在信號轉導過程中，BMPs 必須與配體相結合形成異型低聚體復合物，再與下游SMAD 信號分子結合才可發揮生物學效應。1982年，Davis 等在高繁殖力布魯拉美利奴羊中發現，常染色體的某個基因突變后會導致母羊的高排卵數性狀出現，該基因增加1 個拷貝突變將導致母羊排卵數增加1.65 個[44]。1989 年，綿羊和山羊遺傳學命名委員會將調控布魯拉美利奴羊排卵數性狀的基因命名為FecB（Fecundity Booroola）基 因[45]。2001 年，FecB 基 因突變被定位在BMPR1B 基因上，并認為BMPR1B 基因編碼區發生了A746G 的突變，從而導致蛋白質序列中的第249 位的谷氨酰胺被置換為精氨酸（Q249R）[46]。BMPR1B 為BMP 的I 型受體，其突變后增加了信號轉導過程對下游受體的信號強度，導致卵泡早熟，排卵數增加[45]。已有研究表明，BMP I 型以及II 型受體在小鼠、牛以及綿羊卵母細胞和顆粒細胞中表達[46-48]。在人體顆粒細胞中亦可檢測到BMPRIA、BMPRIB 以及BMPRII[49]。在山羊卵巢中，Costa 等[50]測得BMPRIB以及BMPR II 的mRNA 表達水平在0.2 mm 的卵泡中高于1.0 mm 的卵泡。

SMAD 蛋白是將BMPs 配體信號轉導至細胞核的介導蛋白。Jessica 等[51]利用可識別磷酸化R-SMADs 的抗體監測其信號傳導過程發現，R-SMADs 以高度保守的方式存在于所有物種的信號傳遞途徑中。SMAD1/5/8 為Bmp/Smad 信號轉導通路受體激活型蛋白，它們與活化的I 型受體結合，被磷酸化后與SMAD4 結合轉運至細胞核，使BMPs 發揮轉錄調控作用。在PGCs 分化期間，磷酸化的SMAD1/5/8 蛋白被定位在從細胞核轉移至細胞質的過程中。Okamura 等[52]在小鼠PGCs 體外培養實驗中發現，SMAD1/5 為BMP4 內信號因子，刺激PGCs外胚層的發育，SMAD1 和SMAD5 的協同表達可刺激BMP4 在E5.25～5.5 時PGCs 外胚層的發育。Hayashi 等[53]研究發現，SMAD1 基因缺陷的小鼠在E10.5～11.5 時由于器官發育不全而死亡。又有研究表明，SMAD1 基因缺失的小鼠同樣由于器官發育不全而死亡[8]。這說明二者對于PGCs 的發育過程中起到關鍵作用。SMAD4 作為哺乳動物唯一的通用調節型蛋白，是哺乳動物卵泡發育以及排卵所必需[54]，同時SMAD4 可促進卵巢顆粒細胞成熟分化，通過調節FSH 以及促黃體生成素（LH）的水平對卵巢功能進行調控[55]。Sirard 等[56]研究發現，與所有BMP 受體基因敲除的小鼠一樣SMAD4 基因缺失的小鼠內臟器官不能正常發育而死亡，這說明SMAD4 作為通用型蛋白在Bmp/Smad 信號轉導過程中的重要性。作為抑制型SMAD 蛋白，SMAD6 和SMAD7 通過不同的方式阻止或者干擾信號通路信號的轉導。在哺乳動物中，SMAD6 可特異阻斷Bmp/Smad1 途徑的信號轉導，但是不干擾SMAD1 的磷酸化，從而與SMAD4 競爭結合受體激活的SMAD1，產生無活性的SMAD1-SMAD6復合物，從而阻止信號的傳遞[57]。而SMAD7 主要抑制TGF-β 信號傳導。Nakao 等[58]在非洲爪蟾胚胎研究中發現，SMAD7 的轉染可抑制SMAD2 和SMAD3 的磷酸化，從而阻斷TGF-β 通路信號的轉導。

3 總結與展望

BMPs 發現至今已有39 年歷史，關于該家族成員的功能研究已有大量報道。無論是基因敲除、PGCs 體外培養、卵巢顆粒細胞的培養實驗，均表明BMPs 以及Bmp/Smad 信號通路在哺乳動物PGCs 的形成、卵巢顆粒細胞的增殖、卵母細胞的發育和成熟以及生殖激素的合成和分泌等方面均發揮著重要作用。

世界養羊業共同追求的高繁殖力目標是羊的多羔性狀。在綿羊上進行高繁殖力影響因素的研究具有十分重要的意義，而Bmp/Smad 信號通路顯著影響哺乳動物的繁殖性能，但這些基因的作用機理等方面研究還不夠深入。相信隨著現代生物技術的不斷進步，在Bmp/Smad信號通路中會發現更多影響綿羊多羔性狀的主效基因和候選基因，并對它們加以利用，以更好地促進養羊業發展。