新型香菇母種培養基的篩選

楊煥玲　查磊　趙妍　黃建春　雋加香　陳明杰

摘要：以香菇菌株18為材料，通過對不同培養基的香菇菌絲生長狀況的評價、菌絲生長速度及生物量的分析，以篩選出新型的香菇母種培養基。結果表明，與基礎PDA培養基相比，添加海藻糖的新型培養基對香菇菌絲的生長具有一定的積極作用，能夠促進菌絲的生長速度，有助于菌絲生物量的增加，但不改變其蛋白質組成。綜合來看，PDTA培養基（馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖10 g，海藻糖10 g，蒸餾水1 000 mL）、PTA-2培養基（馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，海藻糖20 g，蒸餾水1 000 mL）更適合香菇18菌絲的培養。

關鍵詞：香菇;培養基;生長速度;生物量;SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）

中圖分類號： S646.1+20.4? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0124-03

香菇（Lentinula edodes）在分類學上屬于擔子菌門（Basidiomycota） 、傘菌綱（Agaricomycetes） 、傘菌目（Agaricales） 、光茸菌科（Omphalotaceae）、香菇屬（Lentinula）（Available online：http：//www.mycobank.org/）。香菇味道鮮美，肉質細嫩，具有獨特的香氣和豐富的營養，含有較高的蛋白質、維生素以及多種類型的礦質元素，有著山珍、菇中之王等美稱[1-2]。香菇具有延緩衰老、防癌抗癌、降血脂血壓及膽固醇、提高機體免疫功能等作用[3]，因此香菇具有很高的食用價值，市場廣闊，是世界上第二大食用菌，提高其產量及品質具有重要意義[4]。

食用菌的培養基是保藏菌種的關鍵，同時也是生產上獲得高產穩產的重要前提[5-6]。目前，香菇常使用的固體培養基主要為馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA培養基）[7]，同時也存在其他少數類型的培養基，例如用農副產品或金銀花藤浸出液制作的香菇母種培養基[8-9]，富硒香菇液體培養基[10-11]，產多糖的液體發酵培養基[12]，碳源、氮源等優化的香菇培養基[13-14]等。海藻糖是一種非還原性二糖，廣泛存在于各種生物體內，能夠增強生物體對高溫、脫水、干旱、冷凍、高滲透性、重金屬及有毒試劑等逆境的抵抗能力[15]。通過外源添加的方式，海藻糖在菌體外部形成保護膜，能起到較好的非特異性保護細胞，使生物膜和蛋白質等在不良環境中免受傷害，并且使菌體不受自身代謝產物影響的作用[16-17]。本試驗采用添加海藻糖的培養基，對香菇18菌株進行培養，將它與常用的基礎PDA培養基進行比較，篩選最佳培養基，不僅豐富了生產上的培養基種類，也在菌種保藏、交替使用培養基防止菌種退化及菌種抗逆等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

香菇菌株18由上海市農業科學院食用菌研究所提供。

1.2 培養基種類

PDA固體培養基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

PDA液體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水 1 000 mL。

PDTA固體培養基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖10 g，海藻糖10 g，蒸餾水1 000 mL。

PDTA液體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，海藻糖 10 g，蒸餾水1 000 mL。

PTA-2固體培養基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，海藻糖 20 g，蒸餾水1 000 mL。

PTA-2液體培養基：馬鈴薯200 g，海藻糖20 g，蒸餾水 1 000 mL。

PTA-5固體培養基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，海藻糖 50 g，蒸餾水1 000 mL。

PTA-5液體培養基：馬鈴薯200 g，海藻糖50 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.3 固體及液體培養方法

所有培養基均在121 ℃下滅菌20 min，冷卻后待接種。在紫外線滅菌30 min后的超凈工作臺上，選用相同生長狀況的香菇菌絲進行接種。固體培養在25 ℃恒溫培養箱中黑暗條件下進行培養，液體培養在25 ℃、150 r/min轉速的恒溫搖床中黑暗條件下進行培養。

1.4 香菇菌絲生長情況及蛋白組成的測定

1.4.1 菌絲生長狀態及生長速度的測定 在長滿菌絲的PDA固體培養基上，分別用直徑為5 mm的打孔器沿菌落邊緣打孔，將菌塊接種于不同類型的固體培養基上，在25 ℃黑暗條件下進行培養，每天定時觀察菌絲的生長形態[18]。分別在接種后培養4、6、8 d用十字交叉法測量菌落半徑，菌落半徑差值（mm）與生長時間（d）的比值即為菌絲生長速度（mm/d）。每組重復3次，計算菌絲平均生長速度并且在培養10 d時對菌絲菌落形態進行拍照。

1.4.2 菌絲生物量的測定 接種后的液體培養基在25 ℃恒溫搖床中黑暗條件下培養到10 d時，菌絲基本長滿搖瓶，處于生長旺盛階段，10 d時收集香菇菌絲。用烘干至恒質量（m1）的濾紙過濾，將菌絲體與濾紙共同烘干至恒質量（m2），計算菌絲體干質量m=m2-m1，每個處理設置3次重復。

1.4.3 SDS-PAGE電泳分析 將在液體培養基中培養10 d的菌絲進行收集，采用TCA（三氯乙酸）/丙酮法提取蛋白質，并用濃度為12.5%的凝膠進行SDS-PAGE電泳分析蛋白質組成。

2 結果與分析

2.1.1 不同培養基對香菇菌絲生長狀況的影響? 將接種后的培養皿置于25 ℃培養箱中黑暗條件下培養，分別在接種后4、6、8、10 d比較觀察菌絲生長狀態，記錄菌絲色澤、邊緣整齊度以及菌落長勢，并劃分如下長勢等級：菌絲潔白粗壯，菌落濃密，菌絲分支多且密，長勢好，邊緣整齊則標記為+ + +;菌絲中等粗壯，菌落濃密，微黃，菌絲分支中等，邊緣較整齊記為+ +;菌絲纖細絨毛狀，微黃至黃褐色，菌落稀疏，邊緣不整齊則記為+[19]。

香菇在4種培養基上10 d的生長狀況見圖1，菌絲生長狀況評價見表1。香菇菌絲在PDA培養基上生長狀況良好，菌絲潔白微黃，菌落較稀疏，菌絲中等粗壯且分支中等，邊緣整齊;在PDTA培養基上長勢較好，菌絲潔白微黃，菌絲中等粗壯且菌落較濃密，菌落邊緣整齊;在PTA-2培養基上長勢最好，菌絲潔白粗壯，菌落濃密，菌絲分支多且密，邊緣整齊;在PTA-5培養基上長勢良好，菌絲潔白微黃，菌落較濃密，菌絲分叉多，邊緣整齊。

2.1.2 不同培養基對香菇菌絲生長速度的影響 香菇在不同的培養基上的菌絲生長速度測定結果（圖2）表明，添加海藻糖的培養基對菌絲的生長速度具有不同程度的提高作用。以基礎培養基PDA為對照，添加海藻糖的培養基中菌絲生長速度與對照具有顯著性差異，其中PDTA培養基中菌絲生長速度與對照具有極顯著性差異。

2.1.3 不同培養基對香菇菌絲生物量的影響 香菇在不同液體培養基中培養的菌絲生物量測定結果（圖3）表明，添加海藻糖的培養基對菌絲生物量具有不同程度的提高作用。與對照相比，香菇在不同培養基中培養后的生物量均有一定程

度提高，但均未達到顯著性差異。

2.1.4 SDS-PAGE電泳 收集不同培養基培養的香菇菌絲，采用TCA/丙酮法提取蛋白質后進行SDS-PAGE電泳，結果（圖4）表明，新培養基的菌絲蛋白質條帶組成與基礎培養基培養的菌絲蛋白質條帶組成無區別， 說明添加海藻糖的培養基并不會改變香菇菌絲的蛋白質組成。

3 討論與結論

香菇新型母種培養基的篩選對香菇菌種的保藏以及生產上高產的穩定性具有重要影響。添加海藻糖的培養基能為香菇菌絲生長提供良好的營養和空間環境，且制作方法簡單，能夠顯著加快菌絲的生長，一定程度上提高菌絲生物量，具有間接增加經濟效益的潛力。海藻糖作為一種穩定的非還原性二糖，具有防止蛋白質變性[20]的作用，而且積累到一定的水平，會響應于高溫[21-22]、碳和氮饑餓[23-25]、氧自由基[26]、脫水[27-28]、冷脅迫[29]、冷凍[28]、甲苯及乙醇[30] 等引發的脅迫性應激[20，31-32]。添加海藻糖培養基的使用，不但能夠為香菇菌絲提供營養來源，而且有助于增強香菇菌絲在培養過程中應對脅迫條件的能力。試驗以普通PDA培養基為對照，對不同培養基培養的香菇菌絲生長狀況進行評價，對菌絲生長速度及生物量進行分析，結果表明，香菇菌絲較適合在PDTA培養基、PTA-2培養基上生長。綜上，本試驗中香菇新型母種培養基可以為深入開展食用菌菌種保藏技術提供參考，同時也揭示了外源添加海藻糖的培養基具有一定的開發潛力。

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