瀕危水生植物水角的離體培養技術

王景飛　符瑞侃　任軍方　黃賽　呂德任　梁定民　戚華沙

摘要：為建立有效的水角離體培養技術，以水角的種子和莖段誘導出不定芽，采用單因素方差分析和Duncans 多重比較法比較不同處理間的差異性，研究糖類、pH值、細胞分裂素和生長素對水角生長狀況的影響。結果表明，以種子為外植體，0.1% HgCl2消毒8 min進而誘導，出現污染率30%，褐化率20%，萌芽率68%，芽點數5.07個;適宜的增殖培養條件為蔗糖30.00 g/L，pH值為6和6-BA 1.00 mg/L，增殖系數均為比較組中的最優值;NAA 0.20 mg/L 較適合水角生根壯苗，根數達6.42條，最長根長9.33 cm，株高10.37 cm，莖粗0.31 cm。水角的離體培養技術探索將有效加快種苗快繁，為瀕危水生植物水角的種質保存提供技術基礎。

關鍵詞：水角;離體培養;不定芽;增殖系數

中圖分類號： S682.320.4+3? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0110-04

水角[Hydrocera triflora （L.） Wight. et Arn.]是鳳仙花科水角屬下的一年生水生草本，是單屬單種植物[1]。該植物澤生、直立、草本;葉狹，互生;花左右對稱[2-3]，呈粉紅色。水角生長于海拔100 m的地區，多生在湖邊、沼澤濕潤地及水稻田中，分布在印度、泰國、印度尼西亞、柬埔寨、越南、斯里蘭卡、馬來西亞、老撾以及我國等地。據《中國植物志》記載，在我國大陸，水角僅分布于海南（陵水、三亞）[1]。由于環境變化，水角分布范圍十分狹窄，處于地區性絕滅狀態（RE）級別[4-5]。水角具有巨大的科研價值、園藝價值和生態價值。由于水角現僅有零星分布，處于原始的自生自滅狀態，因此，深入探索研究水角資源的離體培養技術，對于水角種質保存具有重大意義。

目前關于水角的研究極少，特別是水角的離體培養技術尚未見報導。種子繁殖為鳳仙花科花卉資源的主要繁殖方式[6]，但有些鳳仙花僅產生少量的種子或種子活力低，因而采用扦插和組織培養等營養繁殖方式進行繁殖。鳳仙花科的離體培養技術目前在生產中較少應用，佟鳳芹等對鳳仙花莖段培養與快速繁殖技術的研究發現，鳳仙花莖段可誘導產生大量不定芽，誘導率達100%，在繼代培養過程中，增殖系數大，適合于種苗快速繁殖[7];王越等采用大旗瓣鳳仙花的莖上側芽進行組培培養與快速繁殖，增殖系數在3.50～4.00之間，生根率為100%[8];劉濤等對新幾內亞鳳仙離體快速繁殖技術研究的結果發現，在MS+2.00 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA中培養，頂芽萌發早，生長快，在繼代培養中，增殖系數達6.00，在誘導生根階段，生根率達100%[9];向太和等開展了鳳仙花離體培養再生植株在試管內誘導開花的研究，芽和根誘導分化在MS+3.00 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA培養基中進行，開花誘導的適宜培養基為MS+1.00 mg/L 6-BA+010 mg/L NAA[10]。本研究以水生花卉鳳仙花科水角植物作為試驗材料，研究了水角離體外植體獲得、芽誘導培養、芽增殖培養及生根壯苗培養，旨在建立水角的離體繁殖技術體系，為其進一步開發利用及資源保護提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料取自海南省海口市新坡鎮下市村邊路旁水溝里及邊沿濕地，坐標：110°20′40″E，19°47′3.7″N。試驗所需的KT、ZT、TDZ、IBA、IAA、6-BA及NAA均購自上海伯奧生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體取材 采集整株水角樣本連泥帶水裝進水桶里，帶回試驗地點栽培管理，待接種時取用。采集植株上深褐色的成熟種子，裝進采集袋里密封放置在冰箱保鮮層備用。

1.2.2 外植體消毒和芽誘導培養 選擇生長良好的植株，以莖段及種子作為外植體，莖段帶芽長5 cm，種子用紗布包好，均用自來水沖洗干凈，放置于洗潔精溶液中搖蕩3 min，再用自來水沖洗。瀝干水后，在超凈工作臺上，用無菌水沖洗2次，75%乙醇處理15 s，用0.10%HgCl2浸泡、搖晃，分別設置 5、8、15 min 3種時間處理，無菌水沖洗5次。莖段以莖節為中心，切取組織1 cm。每袋接1個外植體，每個處理接種15袋，重復3次。芽誘導培養基為1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA（除試驗設計需要，其余試驗均添加蔗糖3000 g/L，pH值為6），30 d后統計污染率、褐化率及萌芽率和芽點數。

1.2.3 糖種類對水角增殖培養的影響 以MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA作為培養基，進行 30.00 g/L 的麥芽糖、蔗糖及葡萄糖的糖種類篩選對比試驗。設置每袋接3個單芽（種子誘導出的芽，下同），每個處理接6袋，重復3次。以增殖系數為主，側芽生長狀況、有無愈傷、株高、頂枯數（頂端枯萎）及根數為輔助參考評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關數據并進行統計。

1.2.4 蔗糖濃度對水角增殖培養的影響 以MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA作為培養基，設10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、80.00 g/L 6個梯度處理。設置每袋接3個單芽，每個處理接6袋，重復3次。以增殖系數為主，側芽生長狀況、有無愈傷、株高、頂枯數及根數為輔助參考評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關數據并進行統計。

1.2.5 pH值對水角增殖培養的影響 以MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA作為培養基，設pH值為4、5、6、7、8進行對比試驗。設置每袋接3個單芽，每個處理接6袋，重復3次。以增殖系數為主，側芽生長狀況、有無愈傷、株高、頂枯數及根數為輔助參考評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關數據并進行統計。

1.2.6 不同細胞分裂素對水角增殖培養的影響 以MS作為基本培養基，對6-BA、KT、ZT及TDZ 4種細胞分裂素進行對比試驗，濃度均為1.00 mg/L。設置每袋接3個單芽，每個處理接6袋，重復3次。以增殖系數為主，側芽生長狀況、有無愈傷、株高、頂枯數及根數為輔助參考評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關數據并進行統計。

1.2.7 不同6-BA濃度對水角增殖培養的影響 以MS+0.10 mg/L NAA作為培養基，對6-BA濃度進行對比試驗，設0.20、0.60、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg/L 7個梯度處理。設置每袋接3個單芽，每個處理接6袋，重復3次。以增殖系數為主，側芽生長狀況、有無愈傷、株高、頂枯數及根數為輔助參考評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關數據并進行統計。

1.2.8 不同的生長素種類對水角生根培養的影響 以MS作為基本培養基，對NAA、IBA和IAA 3種生長素進行對比試驗，濃度均為0.50 mg/L。設置每袋接3個單芽，每個處理接6袋，重復3次。以根數、最長根長、株高及莖粗為考核評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關數據并進行統計。

1.2.9 不同NAA濃度對水角生根培養的影響 以MS作為基本培養基，對不同NAA濃度進行對比試驗，設置0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mg/L 6個梯度處理。設置每袋接3個單芽，每個處理接6袋，重復3次。以根數、最長根長、株高及莖粗為考核評價指標。30 d后記錄每個樣本的相關數據并進行統計。

統計方法：污染率=污染數/接種數×100%;褐化率=褐化數/接種數×100%;萌芽率=萌芽數/接種數×100%;增殖系數=不定芽總數/接種數;根數=根總數/接種數;頂枯數=頂枯總數/接種數;芽點數=芽點總數/接種數。

數據處理使用Excel 2010進行整理、統計和制表;用SPSS 18.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析和Duncans多重比較法比較不同處理間的差異性。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒和芽誘導

由表1可知，0.1%HgCl2（加2滴吐溫）3個時間梯度處理對2種外植體消毒效果不同。以莖段為外植體，5 min處理污染率最高，為100%，其次是8 min處理，污染率為60%，15 min 處理的污染率低至30%，且3個處理間差異顯著;從褐化率來看，5 min處理褐化率最低，為10%，與其他2個處理差異顯著;從萌芽率來看，8 min處理的萌芽率最高，達30%，與其他2個處理差異顯著;從芽點數來看，8 min處理的芽點數最高，為4.05個，與5 min處理差異不顯著。綜合比較分析認為，適合水角莖段消毒的時間為8 min。

以種子為外植體，綜合4個考核指標，最佳的處理時間為8 min，污染率30%，褐化率20%，萌芽率68%，芽點數為5.07個。方差分析結果表明，8 min與15 min處理間的污染率差異不顯著;從褐化率及萌芽率來看，8 min處理與5 min處理的褐化率差異不顯著，與15 min處理差異顯著，8 min處理的萌芽率與其他2個處理差異顯著;從芽點數來看，各處理的芽點數數量次序表現為8 min>5 min>15 min，三者間差異不顯著（表2）。

綜合考慮分析，在消毒時間上，莖段和種子均8 min消毒效果最好;在外植體選擇上，種子易萌芽且長勢好，較適合作為外植體進行消毒誘導。

2.2 不同糖種類對水角增殖的影響

從表3看出，不同糖種類對水角增殖的影響效果不同。麥芽糖處理的增殖系數為4.80，無愈傷，莖頂黃化較嚴重，平均每株頂枯數0.83條，且出現較多的根系，平均每株有1.70條，平均株高為5.47 cm;葡萄糖處理的增殖系數為5.90，有愈傷，莖頂黃化較嚴重，平均每株頂枯數0.77條，平均根數達0.90條，平均株高為4.75 cm;蔗糖處理的增殖系數為6.13，無愈傷，莖頂黃化少，平均每株頂枯數0.40條，平均根數達0.90條，平均株高為6.00 cm。由方差分析結果可知，蔗糖與葡萄糖處理的增殖系數差異不顯著，考慮到蔗糖的價格實惠，且培養出來的莖節多，莖頂黃化少，無愈傷形成，因此，蔗糖為水角增殖適宜培養的糖種類。

2.3 不同蔗糖濃度對水角增殖的影響

從表4看出，不同蔗糖濃度對水角增殖的影響呈現相關性。10.00～30.00 g/L蔗糖濃度范圍內，隨著蔗糖濃度升高，水角不定芽增殖系數逐漸增加，且顏色逐漸加深，長勢漸好，可見在一定范圍內，30.00 g/L蔗糖對水角不定芽增殖有明顯的促進作用;30.00～80.00 g/L蔗糖濃度范圍內，隨著蔗糖濃度升高，水角不定芽增殖系數逐漸降低，說明較高和較低濃度蔗糖不利于水角的增殖培養。方差分析的結果表明，20.00～50.00 g/L蔗糖濃度范圍內，4個處理間增殖系數差異不顯著。30.00 g/L蔗糖處理出現莖段節點多，葉綠，生長勢好，因此，水角增殖最佳蔗糖濃度為 30.00 g/L。

2.4 不同pH值對水角增殖的影響

從表5可知，不同pH值對水角增殖的影響效果不同。增殖系數介于2.73～6.25之間，pH值為6處理的增殖系數最高，達6.25。除pH值為4處理，其他4個處理的增殖系數差異不顯著，增殖系數介于4.10～6.25之間;pH值為6處理水角芽粗，葉綠，莖長，頂枯多，根多，因此，適宜水角培養的pH值為6。

2.5 不同細胞分裂素對水角增殖的影響

從表6可看出，不同細胞分裂素對水角增殖有不同的影響。6-BA處理不定芽增殖系數達5.40，無愈傷，不定芽狀況好，芽粗，頂枯數較少，莖節長，平均株高達3.62 cm，根較少，平均每株的根數為0.71條;KT處理不定芽增殖系數為3.44，不定芽狀況適中，芽細，淡黃，莖徒長，平均株高為 4.17 cm，根多，平均每株的根數為1.22條;ZT處理不定芽增殖系數為3.47，不定芽狀況偏差，芽細，微黃，平均株高為 3.58 cm，基部發根多，平均每株的根數為1.19條;TDZ處理不定芽增殖系數為5.24，不定芽狀況良好，有愈傷，芽細，色偏黃，莖較短，平均株高為1.48 cm，發根相對較少，平均每株的根數為0.09條。方差分析結果顯示，6-BA處理不定芽增殖系數與TDZ處理間的差異不顯著，與KT處理及ZT處理間的差異達到顯著水平。綜合比較分析認為，選用6-BA作為增殖激素時，水角的增殖系數最高，芽的生長勢好，芽粗壯，無愈傷，節點多，因此，6-BA較適宜做為水角增殖的細胞分裂素。

2.6 不同6-BA濃度對水角增殖的影響

由表7可知，不同6-BA濃度對水角不定芽的增殖影響極大。空白對比處理不定芽增殖系數為4.73，沒有形成側芽，叢生狀，莖直立徒長，平均株高達9.15 cm;6-BA 0.20 mg/L處理的增殖系數6.03，少有側芽形成，莖徒長，平均株高為10.30 cm，根少，平均每株的根數為3.00條;6-BA 0.60 mg/L 處理的增殖系數6.23，不定芽狀況偏差，平均株高為8.15 cm，基部長根多，平均每株的根數為2.50條;6-BA 1.00 mg/L處理不定芽增殖系數最高，達8.00，不定芽狀況好，芽粗，綠色，平均株高為6.30 cm，長根相對較少，平均每株的根數為0.90條，與其他7個處理間的不定芽增殖系數差異不顯著;6-BA 1.50 mg/L處理不定芽增殖系數為7.20，不定芽狀況中等，芽偏細，平均株高為5.55 cm，平均每株的根數為0.80條;6-BA 2.00 mg/L處理不定芽增殖系數5.50，不定芽狀況中等，芽細，平均株高為5.10 cm，根少，平均每株的根數為0.60條;6-BA 2.50 mg/L處理不定芽增殖系數為5.22，不定芽狀況中等，芽偏細，平均株高為4.05 cm，平均每株的根數為0.37條;6-BA 3.00 mg/L處理不定芽增殖系數為4.80，不定芽狀況中等，芽細，平均株高為4.64 cm，根少，平均每株的根數為0.30條。

綜合分析顯示，當6-BA濃度為1.00 mg/L時，水角不定芽增殖系數最高;6-BA 0～1.00 mg/L處理，增殖系數呈上升趨勢，6-BA 1.00～3.00 mg/L處理，增殖系數呈下降趨勢;在培養中發現，植株根數與濃度呈反相關性。所以，6-BA 1.00 mg/L為適宜的6-BA處理水角增殖的濃度。

2.7 不同生長素對水角生根的影響

由表8可知，不同生長素種類對水角的生根效果不同。3種生長素種類處理間的根數差異達到顯著性水平，分別為6.22、4.70、5.48條。從最長根長來看，3個處理的最長根長介于2.84～7.99 cm，其中NAA處理的最長根最長，達 7.99 cm，與其他2個處理間差異顯著。從株高來看，各處理株高在2.06 cm及以上，其中NAA處理的株高最高，為 6.23 cm。從莖粗來看，NAA處理的莖較粗壯，生長勢為 NAA>IAA>IBA。綜合比較分析認為，適合水角根系發育的生長素種類為NAA。

2.8 不同NAA濃度對水角生根的影響

由表9可知，不同NAA濃度對水角的生根效果差異較大。0.20～0.80 mg/L NAA 4種處理間的根數差異不顯著，分別為6.42、6.40、6.36、6.07條，與1.00、1.20 mg/L NAA處理差異顯著，1.00 mg/L NAA處理的根數最少，為3.59條。從最長根長來看，6個處理的最長根長介于4.44～9.33 cm，其中0.20 mg/L NAA處理的最長根最長，達9.33 cm，與其他5個處理間差異顯著，高濃度NAA處理的最長根長表現出抑制效果，低至4.44 cm。從株高來看，各處理株高在5.08 cm及以上，其中0.20 mg/L NAA處理的株高最高，為10.37 cm。從莖粗來看，NAA處理的莖粗隨著濃度的升高，表現出反相關性。綜合比較分析認為，適合水角根系發育的NAA濃度為0.20 mg/L。

3 結論

本研究對水角進行了外植體的離體培養研究。結果表明，莖段和種子均在0.10% HgCl2下消毒8 min效果最優，莖段消毒和芽誘導的效果分別為污染率60%，褐化率50%，萌芽率30%，一個外植體的平均芽點數為4.05個;種子消毒和芽誘導的效果分別為污染率30%，褐化率20%，萌芽率68%，一個外植體的平均芽點數5.07個;綜合考慮分析，在外植體選擇上，種子數量多，易消毒，且萌芽率高，長勢好，因此，種子較適合作為外植體進行消毒和誘導。在增殖方面，適宜的增殖培養條件為蔗糖濃度為 30.00 g/L，pH值為6和6-BA 1.00 mg/L，增殖系數均為比較組中的最優值，其中以 MS+0.10 mg/L NAA作為培養基，添加1.00 mg/L 6-BA，增殖系數達8.00。在生根方面，進行了NAA、IBA和IAA 3種生長素種類處理的對比，結果表明，適合水角根系發育的生長素種類為NAA;在NAA不同濃度的篩選中，以0.20 mg/L為最佳激素濃度選擇，根數達到6.42條，最長根長為9.33 cm，株高為10.37 cm，莖粗為 0.31 cm，能夠達到生根壯苗的效果。

參考文獻：

[1]中國科學院《中國植物志》編輯委員會. 中國植物志[M]. 北京：科學出版社，2004.

[2]中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒：第二冊[M]. 北京：科學出版社，1983：748.

[3]陳煥鏞，張肇騫. 海南植物志：第一卷[M]. 北京：科學出版社，1964：418.

[4]中國生物多樣性紅色名錄——高等植物卷[M]. 北京：環境保護部，中國科學院，2013.

[5]王景飛，呂德任，黃 賽，等. 海南省瀕危水生植物水角的資源現狀及調查分析[J]. 中國園藝文摘，2017，33（12）：67-69.

[6]周修任，王華新，李進華，等. 鳳仙花科花卉資源研究現狀及展望[J]. 湖北農業科學，2015，54（2）：266-269.

[7]佟鳳芹，欒 嵐. 鳳仙花莖段培養與快速繁殖[J]. 遼寧師專學報，2006，8（3）：107-108.

[8]王 越，劉 燕. 大旗瓣鳳仙花的組培培養與快速繁殖[J]. 植物生理學通訊，2008，44（3）：510.

[9]劉 濤，陳 偉. 新幾內亞鳳仙離體快速繁殖技術研究[J]. 山東理工大學學報，2003，17（1）：103-106.

[10]向太和，王利琳. 鳳仙花離體培養再生植株并試管內開花[J]. 杭州師范學院學報，2005，4（4）：293-294.和建云，楊秀云，趙杏鎖，等. 紫羅蘭種子萌發及幼苗生長對鹽脅迫的響應[J]. 江蘇農業科學，2019，47（3）：114-117.