椰子織蛾CSP基因的克隆與序列分析

袁遠(yuǎn)　高熹　喜超　楊志新　雷騰云　張連根　朱家位

摘要：利用rapid-amplification of cDNA ends（RACE）技術(shù)，克隆獲得了1條椰子織蛾（Opisina aremosella）的全長化感蛋白基因序列。該基因全長為561 bp，開放閱讀框全長為393 bp，3′和5′端非編碼序列分別為48、120 bp，編碼130個氨基酸，所編碼蛋白質(zhì)的理論分子量為14.8 ku，等電點為5.85。同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，椰子織蛾化感蛋白基因氨基酸序列有4個保守半胱氨酸位點且與其他昆蟲化感蛋白基因在氨基酸的水平上相似性不高。除與棉紅鈴蟲（Pectinophora gossypiella）相似度達(dá)71%外，與其他昆蟲相比，均低于10%。SignalP預(yù)測顯示，椰子織蛾化感蛋白基因所編碼的前20個氨基酸為信號肽序列（MAMKYLIVLSCVLAAAIVAG）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，椰子織蛾化感蛋白與稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）、亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）和家蠶（Bombyx mori）化感蛋白1、2、3、4聚為同一族，與家蠶化感蛋白1、2、3、4的進(jìn)化程度最近。這為深入研究昆蟲化學(xué)感受蛋白、揭開昆蟲與環(huán)境化學(xué)信息聯(lián)系的規(guī)律奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：椰子織蛾;化感蛋白;基因克隆;序列分析;系統(tǒng)進(jìn)化樹

中圖分類號： S433.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0043-03

高度發(fā)達(dá)的化學(xué)感受系統(tǒng)對昆蟲與環(huán)境中的化學(xué)信息聯(lián)系具有重要作用。昆蟲在長期進(jìn)化過程中，發(fā)展演變出復(fù)雜的化學(xué)信息感受機(jī)制。例如，在覓食、尋偶、產(chǎn)卵等行為中，通過敏銳的嗅覺、味覺、觸覺等功能，感受各種環(huán)境化學(xué)因子的刺激，從而進(jìn)行精巧的化學(xué)通信，以適應(yīng)環(huán)境選擇，保持種群繁衍[1]。昆蟲發(fā)達(dá)的化學(xué)感受系統(tǒng)功能的發(fā)揮是基于昆蟲各種感器淋巴液中分布著大量的化學(xué)感受蛋白（chemosensory proteins，簡稱CSPs）和氣味結(jié)合蛋白（odorant-binding proteins，簡稱OBPs）。環(huán)境中的氣味分子與各種嗅覺相關(guān)蛋白結(jié)合后，被運送至嗅覺神經(jīng)末梢，從而引發(fā)以嗅覺功能為主的各種化學(xué)感受反應(yīng)[2-3]。自1994年McKenna等首次在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）觸角中發(fā)現(xiàn)2種與傳統(tǒng)的氣味結(jié)合蛋白無論在結(jié)構(gòu)還是在功能上都有明顯差別的蛋白后，研究者們隨后相繼又在多個目的昆蟲如雙翅目、直翅目、半翅目、膜翅目、鱗翅目、鞘翅目、脈翅目等中鑒定了大量編碼CSP的基因[4-6]。由于此類蛋白主要存在于昆蟲各種化學(xué)感受器，與感受環(huán)境化學(xué)刺激有關(guān)，所以又稱之為昆蟲化學(xué)感受蛋白（chemosensory protein，簡稱CSP）。CSP種類具有多樣性，表達(dá)部位也不僅僅局限于感受器官，昆蟲CSP在身體各部分的表達(dá)分布具有全面性，種類具有多樣性，種間種內(nèi)分布具有普遍性，而且在雌雄蟲中均有表達(dá)，這些特點易于適應(yīng)接受復(fù)雜的環(huán)境化學(xué)刺激信息，承擔(dān)復(fù)雜的化學(xué)感受功能[7]。CSP在昆蟲行為中扮演著重要角色，故對其進(jìn)行深入研究，這不僅能闡明昆蟲化學(xué)感受蛋白的作用機(jī)制，更有助于深入解析昆蟲與環(huán)境信息交流本質(zhì)，為進(jìn)一步開拓害蟲防治和益蟲利用新途徑提供了重要基礎(chǔ)。

目前，有關(guān)昆蟲化學(xué)感受蛋白的研究主要集中于一些較常見的農(nóng)業(yè)害蟲，如煙粉虱、棉花粉蚧、西花薊馬等。對于椰子織蛾化感蛋白基因的研究相對來說就很少了，但其危害性卻不容忽視。2013年8月，我國首次在海南省萬寧市興隆鎮(zhèn)華僑農(nóng)場的椰林中發(fā)現(xiàn)椰子織蛾（Opisina aremosella Walker），風(fēng)險分析表明，該蟲在我國屬于高度危險性有害生物，風(fēng)險值（R值）達(dá)2.20[8]。鑒于椰子織蛾危害的嚴(yán)重性，于2014年被國家林業(yè)局列為林業(yè)危險性有害生物[9]。目前，國內(nèi)對椰子織蛾的基因研究較少，僅有關(guān)于形態(tài)特征、生物生態(tài)學(xué)及生物防治方面的介紹性報道[10-11]。因此，本研究對椰子織蛾的化感蛋白進(jìn)行克隆和序列分析，旨在探索椰子織蛾感知外界環(huán)境化學(xué)信號的作用機(jī)制，為今后對該蟲防治提供新思路和新途徑、研究昆蟲與環(huán)境之間信息聯(lián)系的本質(zhì)規(guī)律奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲

椰子織蛾于2016年采自海南椰子樹，于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室以香蕉葉片為寄主培養(yǎng)，待羽化至成蟲收集作為試驗材料。

1.2 總RNA的抽提

總RNA的抽提采用TRIZOL試劑盒（Invitrogen）提取。

1.3 RACE

以新鮮抽提的椰子織蛾總RNA為材料，利用Clontech公司的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，合成3′和5′ RACE cDNA模板，以合成的cDNA為模板，參照RACE試劑盒說明書克隆該基因的5′端和3′端序列。PCR采用Advantage 2 PCR kit（Clontech）。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸2.5 min，循環(huán)40次;72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果，對目的條帶進(jìn)行切膠回收后并純化。用TA克隆法連接pGEM-T-easy載體（Promega），轉(zhuǎn)化宿主菌為DH5α。在X-Gal和IPTG的存在下，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑陽性克隆于金思特科技（南京）有限公司測序。

1.4 序列分析

核苷酸序列的翻譯和氨基酸序列的比對分析分別使用GENETYX-MIN 5.1和ClustalX 1.83軟件[12]，蛋白信號肽的預(yù)測使用SignalP在線分析工具[13]，結(jié)構(gòu)域預(yù)測采用M Motifscan[14]，分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建采用MEGA 4.0進(jìn)行[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA克隆及序列分析

將3′和5′ RACE擴(kuò)增所得目的基因片段進(jìn)行拼接，共得椰子織蛾化感蛋白基因的全長序列為561 bp，開放閱讀框全長為393 bp，命名為OarCSP（圖1）。3′和5′端非編碼序列分別為48、120 bp，該基因編碼130個氨基酸，預(yù)測分子量和等電點分別為14.80 ku和5.85。SignalP預(yù)測顯示，該蛋白的前20個氨基酸為信號肽序列（MAMKYLIVLSCVLAAAIVAG）。結(jié)構(gòu)分析表明，OarCSP氨基酸序列中潛在1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（TGCE72-75）、2個N-豆蔻酰化位點（GQKYTD20-25和GCEKCT73-78）、2個蛋白質(zhì)激酶C磷酸化位點（TDK24-26和TPR121-123）和1個酪氨酸激酶磷酸化位點（TGK110-112）。

2.2 同源性比較和進(jìn)化分析

應(yīng)用ClustalX對OarCSP與其他昆蟲化感蛋白的氨基酸進(jìn)行序列比對。由圖2可知，OarCSP氨基酸序列具有4個保守半胱氨酸位點，與鱗翅目其他昆蟲相似性不高，其中與棉紅鈴蟲（Pectinophora gossypiella）、桃蛀螟（Conogethes punctiferalis）、茶尺蠖（Ectropis obliqua）、稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）和菜粉蝶（Pieris rapae）的相似性分別為71%、5%、9%、6%、8%。應(yīng)用MEGA 4.0鄰接法（neighbor-joining，簡稱NJ）對OarCSP與鱗翅目其他昆蟲CSP氨基酸序列進(jìn)行分子進(jìn)化分析，構(gòu)建NJ進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，鱗翅目夜蛾科、蠶蛾科、螟蛾科的化感蛋白聚為2個族，OarCSP與化感蛋白OfurCSP、CmedCSP1、BmorCSP1、BmorCSP2、BmorCSP3、BmorCSP4同源性高，聚為一族。

該分析所用20個鱗翅目昆蟲化感蛋白的GenBank登錄號如下：HassCSP[煙青蟲（Helicoverpa assulta）]，ABB91378.1;OfurCSP[亞洲玉米螟（O. furnacalis）]，BAV56805.1;CmedCSP1[稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）]，AIX97823.1;CmedCSP2，ALT31606.1;MbraCSP[甘藍(lán)夜蛾（Mamestra brassicae）]，AAF71289.1;MsepCSP[黏蟲（Mythimna separata）]，JAV45867.1;AipsCSP1[小地老虎（Agrotis ipsilon）]，AGR39577.1;AipsCSP2，AAP57460.1;AdisCSP（Athetis dissimilis），ALJ93810.1;SexiCSP[甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）]，AKT26484.1;HarmCSP1[棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）]，AAK53762.1;HarmCSP2，AFR92097.1;CaurCSP[臺灣稻螟（Chilo auricilius）]，AIU68827.1;HzeaCSP[美洲棉鈴蟲（Helicoverpa zea）]，AAN63675.1;BmorCSP1[家蠶（Bombyx mori）]，NP_001037052.1;BmorCSP2，AAV34688.1;BmorCSP3，AFF18000.1;BmorCSP4，AFD97753.1;SlitCSP[斜紋夜蛾（Spodoptera litura）]，ALJ30219.1。

3 結(jié)論與討論

在研究昆蟲對環(huán)境化學(xué)因子刺激感受機(jī)制的過程中，起初的研究重點是對氣味的感受機(jī)制，昆蟲化學(xué)感受蛋白的研究源于對昆蟲氣味結(jié)合蛋白的研究。然而，人們發(fā)現(xiàn)昆蟲對環(huán)境化學(xué)因子刺激的許多行為反應(yīng)并不能用氣味結(jié)合蛋白和氣味感受機(jī)理來解釋，直到20世紀(jì)90年代CSP的發(fā)現(xiàn)，才為昆蟲對環(huán)境化學(xué)因子刺激感受機(jī)理開辟了新的途徑。本研究利用RACE技術(shù)，從椰子織蛾中克隆獲得1個CSP基因，根據(jù)其cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列表明，OarCSP具有昆蟲化感蛋白的典型特征：相對分子量小，為14.80 ku，N-端存在20個氨基酸左右的信號肽，具有4個保守的半胱氨酸位點和典型的化感蛋白結(jié)構(gòu)域，這體現(xiàn)了不同昆蟲化感蛋白在進(jìn)化過程中的保守性。通常，每一種昆蟲中都存在多個化感蛋白基因，特別是近年來隨著基因組學(xué)的迅猛發(fā)展，許多化感蛋白已迅速地從昆蟲基因組中被發(fā)掘，如從黑腹果蠅、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、意大利蜜蜂和家蠶的基因組中分別獲得4、8、6、22個化感蛋白基因，且有假基因的存在。同時還發(fā)現(xiàn)，CSP編碼基因數(shù)目在各昆蟲物種中都少于化學(xué)感受受體（OR或GR）和OBP編碼基因數(shù)，還有很多化感蛋白沒有被發(fā)現(xiàn)[16]，據(jù)此可知，更多的椰子織蛾化感蛋白基因有待克隆獲得。多序列同源性分析表明，OarCSP與同目的昆蟲相似性均較低，這主要是因為迄今化感蛋白僅在家蠶、小地老虎、棉鈴蟲、煙青蟲等少數(shù)鱗翅目昆蟲中報道，尤其是在織蛾科鮮有報道的緣故。此外，這體現(xiàn)了不同昆蟲物種在生物演變過程中化感蛋白的進(jìn)化現(xiàn)象，也反映了不同昆蟲之間化感行為的多樣性，這可能是不同昆蟲在適應(yīng)不同環(huán)境中接受復(fù)雜化學(xué)信息刺激的進(jìn)化結(jié)果。經(jīng)分子進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，OarCSP與化感蛋白OfurCSP、CmedCSP1、BmorCSP1、BmorCSP2、BmorCSP3、BmorCSP4聚為同一族，表明它們應(yīng)為同一家族，尤其是OarCSP與家蠶化感蛋白BmorCSP1、2、3和4的進(jìn)化程度最近，它們之間的組織表達(dá)分布、生理功能等應(yīng)相似。

昆蟲與環(huán)境之間的化學(xué)通信對于昆蟲生存和繁殖至關(guān)重要，昆蟲CSP遍布幾乎所有感受器，起到感受、溶解、運輸、傳導(dǎo)環(huán)境化學(xué)刺激因子的作用[17]。其對昆蟲感知外界化學(xué)環(huán)境的變化具有關(guān)鍵作用。通過研究CSP開發(fā)害蟲產(chǎn)卵忌避劑等“昆蟲行為防治劑”，以及益蟲利用新技術(shù)等一直是國內(nèi)外研究的熱點和目標(biāo)。通過掌握昆蟲對環(huán)境化學(xué)刺激的分子感受機(jī)制，闡明昆蟲行為反應(yīng)的本質(zhì)，有利于提高益蟲利用和害蟲治理效率。但要明確昆蟲化學(xué)感受蛋白的化學(xué)信息轉(zhuǎn)換、信號傳導(dǎo)過程，還要對昆蟲化感蛋白進(jìn)行深入研究，才能為防治害蟲和利用益蟲提供新思路和新途徑。本研究克隆獲得椰子織蛾氣化感蛋白OarCSP的基因全長序列，為深入研究昆蟲化學(xué)感受蛋白，揭開昆蟲與環(huán)境化學(xué)信息聯(lián)系的規(guī)律奠定理論基礎(chǔ)。

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