喹諾酮類抗生素在水產養殖中應用的研究進展

張石云　宋超　陳家長

摘要：喹諾酮類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌效果明顯、安全性較高和價格低廉等優點，因而被廣泛應用于水產養殖動物細菌性感染癥的防治。近年來，其長期大量的使用帶來了一系列潛在的風險，導致其進入了一個爭議階段。鑒于現階段抗生素在病害防治上的不可完全替代性和喹諾酮類抗生素使用的弊端，筆者就喹諾酮類抗生素在水產養殖上的應用現狀、藥物殘留、耐藥性及其風險評價（環境風險評價和膳食風險評價）進行綜述，并對其在未來一定時間內在水產養殖上的應用進行分析和展望，以期為水產養殖可持續發展提供一定的理論依據。

關鍵詞：喹諾酮;耐藥性;殘留與風險評估;水產養殖;研究進展

中圖分類號： S948? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0032-05

自第一個喹諾酮類抗菌藥萘啶酸被發現以來，喹諾酮類藥物（QNs）就在治療細菌感染方面發揮著重要作用，至目前為止共開發了4代。其在全球的抗生素市場約占18%的份額[1]（在2007年，僅左氧氟沙星/氧氟沙星的世界市場銷售額就高達16.45億美元），良好的市場份額證明，喹諾酮合成抗菌藥已成為醫、農、林和漁行業常用的抗生素，其極好的市場前景極大地刺激了科研人員開發和完善藥物的研究，喹諾酮類藥物的抗菌譜和抑菌效果有了較大進展[2]，如抗菌譜，從萘啶酸僅對部分革蘭氏陰性菌具有一定的抗菌活性到氟喹諾酮類對革蘭氏陰性菌和陽性菌的廣譜性抑菌效果[3]。在喹諾酮類藥物的細菌耐藥性和多重耐藥性問題上，從第1代到第4代也有很大改善;同時其藥效動力學和細胞毒性方面的改良也顯著提高了喹諾酮類抗生素的使用安全性。喹諾酮抗菌藥物的抑菌機制是通過抑制細菌內DNA gyrase（DNA旋轉酶）和拓撲異構酶Ⅳ的活性，使得細菌的復制、轉錄、修復和細菌細胞壁的染色體分裂等過程受阻，從而阻斷細菌DNA復制[4-5]，使得細菌失活;對病菌的致死效應主要看其與解旋后的DNA形成的斷裂復合體的穩定性[1]。

20世紀70年代，喹諾酮類抗生素開始在水產養殖行業使用[6]，在我國，主要在南方養鰻業中使用[7]。喹諾酮類抗生素被廣泛應用于水產養殖業與青霉素的應用歷程類似。近30年來，隨著國內水產養殖集約化的不斷發展，水產養殖單位面積產量顯著增加，導致由細菌和真菌引起的魚病頻發[8]。然而，在細菌性疾病的防治上，呈現出藥物種類混雜、同類藥物一同使用、超量使用形成的選擇壓力造成細菌耐藥性不斷增強，導致藥物防治進入了惡性循環。一方面，為了防治魚病，藥物防治細菌性疾病仍是主要途徑，抗生素顯著的抗菌能力和低副作用使其成為水產養殖上疾病防治的常用藥物;另一方面，喹諾酮類抗菌藥物與其他抗生素（如頭孢類、四環素等）相比具有抗菌譜廣、抗菌力強、安全性高、價格低廉、毒副作用低和降解快等特性，深受養殖戶喜愛，加上氯霉素、紅霉素等藥物相繼被禁用，使得喹諾酮類抗生素被長期廣泛地應用于魚類細菌性疾病的防治。目前，市面上流通的藥品主要以含氟的氟喹諾酮類抗生素為主，如洛美沙星、伊諾沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、培氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星和氟甲喹等，隨著對喹諾酮類抗生素在環境中的殘留和風險評價研究的不斷深入，不少氟喹諾酮抗生素已逐漸被我國歸為食品動物生產過程中的禁用藥物。

1 喹諾酮類抗生素在水產養殖上的應用概況

1.1 應用方式

市面上的喹諾酮類藥物通常是粉末狀，一般通過溶解后直接潑灑和拌料施入魚池，直接潑灑起到抑制水環境中病菌的作用;拌料則可進入養殖動物的體內從而抑制動物體內致病菌，同時還能調節腸道微生物結構。在疾病暴發時，通常2種方式并用。

1.2 水產養殖上常見的喹諾酮類抗生素種類

1.2.1 恩諾沙星 恩諾沙星（enrofloxacin）是氟喹諾酮類（fluoroquinolones）化學合成抑菌劑的代表藥物，又名乙基環丙沙星;市售的恩諾沙星一般為微黃色或淡黃色結晶狀粉末，不溶于水，易溶于有機溶劑或氫氧化鈉溶液等堿性溶液[9]。恩諾沙星具有廣泛的抗菌譜，對革蘭氏陽性菌、陰性菌及霉漿體均具有顯著的抑菌效果，一般用于防治因弧菌和大腸桿菌引起的養殖魚類疾病[9-10]。恩諾沙星在機體內起作用的主要活性成分是環丙沙星（恩諾沙星被機體代謝脫去乙基形成環丙沙星）。目前大部分學者認為，恩諾沙星應用在水產養殖中防治細菌性疾病是安全的。如有研究表明，恩諾沙星對魚體的組織酯酶同工酶和血液指標的影響都比較小，基本不會影響魚體的正常代謝機能，且對機體損傷程度較小[11];鱘魚口灌恩諾沙星的急性毒性試驗的半數致死量為 1 590.36 mg/kg （以單位體質量的用量計），95%可信區間范圍為1 172.20～1 803.02 mg/kg （以單位體質量的用量計）[12]，說明恩諾沙星對水產養殖經濟動物的毒性極低。

1.2.2 諾氟沙星 諾氟沙星（norfloxacin）是第一個含氟的喹諾酮類藥物，它對需氧性革蘭氏陰性桿菌具有顯著的抗菌作用。由于該藥抗菌譜廣泛、效果顯著，同時具有較高的安全性和價格低廉等特性，導致其在水產養殖行業中被頻繁使用，成為水產品中最可能殘留的藥物之一;另外藥效動力學表明，諾氟沙星在組織材料（如魚肉）中的殘留量要高于體液中的殘留量[13]，因此其不規范的使用不但會產生耐藥性風險，同時也會對水產養殖業的可持續發展和消費者的健康產生潛在的風險。農業部第2292號公告規定，從2016年12月31日起，在食品動物生產加工過程中禁止經營、使用諾氟沙星。

1.2.3 環丙沙星 環丙沙星（ciprofloxacin）的活性為諾氟沙星的2～4倍，它對球菌（如鏈球菌等）和桿菌（腸桿菌等）均具有顯著的抑制效果。在過去，環丙沙星常被施用以防治細菌性爛鰓病和赤皮病，導致其在環境和水產品中有廣泛的殘留。研究表明，長時間攝入低劑量的環丙沙星會導致機體對喹諾酮類抗生素產生廣譜的耐藥性，同時環丙沙星對人體肝腎存在嚴重的毒副作用[14];考慮到曾用量和環境中殘留廣泛的特點，我國在2002年就將環丙沙星列為水產養殖禁用藥物。在水產品膳食風險評估時環丙沙星也是抗生素藥物的必檢項。

2 存在的問題

隨著水產養殖業的快速發展，大量的抗生素被應用在水產養殖疾病防治環節。喹諾酮類抗生素以其抗菌廣譜性、代謝快、低殘留和低毒副作用等特點成為最常用的抗生素之一。盡管使用抗生素能維持良好的水環境，預防疾病的暴發[15]，促進生長，提高產量[16]，但由于其長期大量使用，帶來的問題也日益突出，主要體現在耐藥性、毒副作用和殘留3個方面。

2.1 細菌耐藥性

細菌耐藥性是指細菌長期暴露在常規劑量環境中，導致抗菌藥物不能有效抑制或殺死細菌的狀態，分為天然性耐藥和后天的獲得性耐藥。細菌對喹諾酮類藥物的耐藥性問題一直是學者們研究的重點，研究表明，細菌對喹諾酮類藥物的耐藥性機制一般有以下3種：發生在染色體上的喹諾酮類耐藥決定區（quinolones resistance determining region，簡稱QRDR）靶基因突變產生耐藥性;質粒介導下對喹諾酮類藥物產生耐藥（plasmid-mediated quinolones resistance，簡稱PMQR）;胞膜通透性改變，主動將喹諾酮類藥物外排[17]。

之前的研究發現，許多致病菌不易對喹諾酮類抗生素產生獲得性耐藥性[18]。近年來，通過對喹諾酮類抗生素抗性基因產生過程的深入研究發現，殘留在水產養殖環境中的喹諾酮類藥物會導致水生細菌產生喹諾酮抗性基因[19]，而攜帶喹諾酮抗性基因的水生細菌質粒可能是抗性基因轉入人類病原體的來源[20];不同的PMQR耐藥基因既能獨自出現并發生作用，又能在同一質粒上共同產生耐藥性[21];喹諾酮類藥物在水產養殖上的不斷過量使用，導致喹諾酮類藥物選擇壓力增加;當選擇壓力足夠大時，喹諾酮抗性基因在不同細菌間的轉移障礙就會被打破[22]，從而產生更多攜帶抗性基因的細菌。這些新的研究成果表明，如果繼續長期大量使用喹諾酮類藥物，許多廣譜抗藥性細菌會危害養殖魚類和人類消費者的身體健康。近年來，國內外關于細菌中PMQR基因的報道以人源及畜禽源腸桿菌科細菌中檢出的較多。Pico等進行了關于瑞士湖水生環境中qnr S1基因的研究[23];Yeh等對質粒介導下大腸桿菌耐藥性的研究發現，在陽性菌中PMQR基因的檢出率從大到小依次為qnr S1、aac（6′）-Ib-cr、qnrb2[24];Albornoz等在阿根廷的研究發現，質粒介導的喹諾酮耐藥率中，PMQR基因的總患病率為8.1%[25];Han等對水、魚體中運動型氣單胞菌中的qnr S5基因進行描述和對氣單胞菌中質粒攜帶qnr S2基因進行了研究[26-27];Xia等對qnr VC4、qnr B1和qnr B17的流行情況進行了研究[28-30]。上述研究表明，PMQR基因的研究已經逐漸成為喹諾酮類抗生素細菌耐藥研究的熱點。

2.2 毒副作用

除了早前被禁用的格帕沙星和克林沙星外，其余的藥物都因使用頻繁而在環境中呈現出“偽持久”狀態。近年來部分學者的研究佐證了喹諾酮類藥物的低毒副作用：陳柳芳通過設定不同濃度的恩諾沙星、環丙沙星和氧氟沙星處理斜生柵藻，發現其半致死濃度均高于50 mg/L，安全濃度為5 mg/L以下，證明這3種喹諾酮類抗生素是低毒副作用藥物[31];吳志剛將錦鯉分別長期和短期暴露在含有氧氟沙星、諾氟沙星和環丙沙星的養殖環境中，發現氧氟沙星、諾氟沙星和環丙沙星對錦鯉均屬于低毒性物質[32]。但由于在水產養殖過程中大量的喹諾酮類抗生素會同其他種類的抗生素一起使用，長期大量使用導致抗生素及其代謝產物在水環境中呈現出“偽持久”狀態，對此有學者研究了恒量混合β-二酮抗生素（氟喹諾酮類、四環素類）對斑馬魚的毒性試驗，發現在類似農場（水產養殖魚池和畜牧場）、醫院等特殊環境的濃度刺激下，斑馬魚的線粒體和心臟組織有不同程度的損傷，也就是說生物長期暴露在混合β-二酮抗生素的環境中有一定的健康風險，同時表明，氟喹諾酮類可能對人體有一定的毒害作用[33]。

2.3 微生態環境的破壞

喹諾酮類抗生素的廣譜抗菌性能抑制許多種類的致病微生物，同時也會抑制水環境中和養殖動物腸道中的有益微生物，如水體中的光合細菌、硝化細菌和機體內的乳酸桿菌和部分弧菌。這是因為其廣譜抗菌性和殺菌機制，導致環境中抗生素的慢性和亞急性污染會對微生物群落形成選擇壓力，這種選擇壓力幫助具有抗性或者非易感性的菌群生存下來[34]。盡管環境水體中抗生素的濃度通常低于最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，簡稱MIC），但促發細菌進行DNA轉錄和突變的效應依然存在[35]。因此，抗生素使用不僅能夠抑制目標細菌生長，產生抗性細菌，也能夠影響微生物群落的多樣性格局，即影響非目標細菌的生長與活性[36]。非目標細菌受到抑制，就會打破水生動物體內和水環境的微生態平衡，導致水環境惡化，水質變壞，機體出現消化吸收障礙，從而引起新的疾病。

陳孝煊等研究發現，當口灌諾氟沙星量達到2.0 mg/kg時，中華鱉消化道中的細菌數量明顯減少，且各優勢菌群的比例會隨著用藥劑量的增大發生變化，其中腸桿菌、氣單胞菌和弧菌的改變較為顯著[37];同樣地，楊雨輝等給鯉魚口灌服乳酸環丙沙星后，發現鯉魚腸道微生物的數量和組成比例都發生了明顯改變，其腸道優勢菌群從氣單胞菌屬Aer、產堿菌屬AIc、不動桿菌屬Aci和腸桿菌科Ent變為氣單胞菌屬Aer和腸桿菌科Ent[38]。

2.4 殘留情況

抗生素在環境和生物體內的殘留問題是當下水產養殖相關科技工作者迫切需要解決的問題。對于喹諾酮類抗生素而言，早在1995年就被確定為持續性污染養殖底泥的物質[39]。環境中喹諾酮類抗生素的殘留量和殘留的種類直接關系到細菌耐藥性（選擇壓力的大小在一定程度上決定著喹諾酮抗性基因跨物種轉移）和毒副作用（環境中恒量混合β-二酮抗生素的種類和濃度決定其毒副作用大小）[22-33]。部分研究表明，環境中殘留的喹諾酮類抗生素不但影響了養殖水環境的平衡，同時由于養殖水體的排放，殘留的喹諾酮類抗生素進入周邊水環境，使得整個流域水環境都受到來自喹諾酮類抗生素的威脅。

3 檢測方法及其污染情況

3.1 檢測方法

檢測方法根據檢測需要分為定性檢測和定量檢測2種。常用的定性檢測法為微生物抑制分析法（MIA）[40]和免疫分析測定法[41]，前者操作方法是將組織和抗微生物藥物均勻分散到瓊脂培養皿中，通過抑菌圈等來確定，但其靈敏度和精確度不盡如人意[42];后者是利用氟喹諾酮類（FQNs）藥物分子結構中的羧基與載體蛋白上游離氨基的縮合反應，將FQNs與載體連接形成人工抗原后的顏色改變（復合物和酶結合的顏色或底物的顏色變化）來定性的，該方法適用于快速篩選和鑒別FQNs。

定量檢測一般通過大型的色譜分析儀器實現，常見的方法有薄層色譜法[43]、高效毛細管電泳法[44]、液相色譜法[45]和液相色譜-質譜聯用法。目前常用超高效液相色譜-質譜聯用法來檢測水產品中抗生素的殘留，幾乎所有重要的QNs均已建立了液相色譜串聯質譜（LC-MS）分析法。但不同樣品的干擾機制（主要是碳水化合物、脂質和蛋白質的干擾）和樣品前處理方法給樣品檢測帶來一定的困難;由于同一類型樣品的基質干擾基本是一致的，因此樣品的前處理尤為重要[46]。目前常用的前處理方法有2007年的國標法（旋轉蒸發）和分散固相萃取（DSPE）。國標的旋轉蒸發法試驗步驟繁多，其中復溶、轉移和蒸發的溫度都存在著樣品中抗生素的損失從而影響試驗結果;分散固相萃取中的QuEChERS提取法（近年來國際上新發展的一種用于農產品檢測的快速樣品前處理技術）因其操作簡單（加除雜萃取劑和硫酸鎂除水劑后離心，取上清稀釋后過柱和濾膜后即可上機檢測）、轉移次數少（損失低）、安全高效、性能穩定而倍受歡迎。

3.2 主要污染種類與殘留水平

對環境而言，抗生素污染是由長期大量使用和抗生素較低的利用率（20%～30%）導致環境中存在大量的抗生素及其代謝物，這些殘留的抗生素一方面使得細菌耐藥性增加，同時存在一定毒副作用。我國每年生產的喹諾酮類抗生素多半都被用于畜禽和水產養殖業，而水產養殖上的抗生素能以水為載體進入養殖場周圍的野外水體環境[47]，此外水環境中殘留的藥物會被食碎屑生物和野生魚類攝食，使得野外水環境被污染[48]，因此水產養殖行業的抗生素污染是我國抗生素污染的主要來源之一。近年來，許多學者在水產養殖發達的長江流域和珠江流域做了大量關于抗生素在水環境（水體和沉積物）和水產品中殘留的研究，發現在珠江流域喹諾酮類抗生素污染物主要是諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星和環丙沙星[16，49-51];依諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星和雙氟沙星是長江流域主要殘留的喹諾酮類抗生素[52-53]。

對消費者來講，水產品中殘留的抗生素就是一種污染，消費者食用有抗生素殘留的水產品有一定的健康風險。目前對于水產品中抗生素殘留的研究以海水水產品為主，關于淡水水產品中抗生素殘留的研究鮮有報道，一般有水產養殖地區（包括周邊野外水環境）抽樣檢查和水產品市場抽檢2種模式[49-54]。馬波沙星、環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星和恩諾沙星是喹諾酮類抗生素在水產品體內常見的殘留種類，其中以恩諾沙星的檢出率最高和殘留量最大，部分結果顯示，部分水產品中恩諾沙星的殘留量已超過聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織（FAO/WHO）規定的50 μg/kg，檢出率為46.9%，最大殘留量為67 μg/kg[54]。

4 風險評估

抗生素的風險評估分為對消費者（主指人類）的膳食風險和對生態環境影響的生態風險。由于生態環境的復雜性，同時考慮到目前喹諾酮類抗生素在環境中殘留的水平和種類沒有對生態環境中生物的生存和維持環境穩態有明顯的威脅，因此目前風險評估的研究主要集中于人類的膳食風險評估。

膳食風險評估研究是通過采集水產養殖區和水產品市場的水產品，進行藥殘檢測獲得水產品中抗生素殘留濃度，然后與國內、國際組織規定的最大限定殘留值（MRLs）進行比較，或通過估算出每日可能攝入量[EDIs，計算公式一般為 EDIs=C×K和EDIs=（C×K）/BW。式中：C為樣品中藥殘濃度，K為正常人平均每天消費量，BW為標準體質量]和國內、國際組織規定的每日允許攝入量（ADIs）進行比較，來評價某一地區正常人正常飲食生活下食用有喹諾酮類藥物殘留的水產品后潛在的健康風險[16，50-51，54]。部分學者的相關研究表明，目前喹諾酮類抗生素在水產品中的殘留濃度，除了部分樣品中恩諾沙星略高于MRLs，有一定的膳食風險外[30]，其余種類對于正常人幾乎沒有膳食風險，但敏感人群還需注意[16，50-51，54]。

生態環境風險評價一般通過風險熵（RQ）來進行[55]，RQ的計算公式為RQi=MECi/PNEC。式中：RQi為物質i的風險熵;MECi為物質i實際監測的濃度;PNECi為物質i的預測無效應濃度。根據風險評價標準，污染物的生態風險被分為4個等級：RQ<0.01，為無明顯風險;0.01≤RQ<0.1，為低風險;0.1≤RQ<1，為中等風險;RQ≥1，為高風險。

5 總結與展望

在殘留與風險評估方面，考慮到喹諾酮類抗生素檢測技術的復雜性，要加強對喹諾酮類抗生素在各種介質中的遷移轉化規律的研究，以便了解其在不同介質中的賦存形態，為檢測提供便利。此外要加強喹諾酮類藥物的毒性效應和機制的研究，了解喹諾酮類藥物的毒理機制和未知的威脅，為制定MRLs和ADIs提供理論依據，此外要加強喹諾酮類抗生素對生態環境平衡潛在影響的研究。

細菌耐藥性是抗生素使用和危害最大的問題，喹諾酮類抗生素的細菌耐藥機制復雜多樣且多能導致多重耐藥性和抗性基因的種間轉移，因此很有必要加強喹諾酮類抗菌藥的細菌耐藥機制和抗性基因研究，包括喹諾酮類抗生素及其抗性基因的檢測、監測方法和體系，養殖和野外水體環境中2種污染物的分布情況的研究等，同時要建立其生態環境安全評價體系及預警體系等。