酶解條滸苔蛋白制備抗肺癌活性多肽

段訓威 肖桂清 王禮興 吳文林 戴聰杰 董樂

（1. 泉州師范學院，泉州 362000；2. 福建省銀豐干細胞工程有限公司，泉州 362000；3. 福建醫科大學附屬第二醫院，泉州 362000；4. 福建省海洋藻類活性物質制備與功能開發重點實驗室，泉州 362000）

美國NCI篩選出了幾萬個天然抗腫瘤化合物，約5%來源于海洋生物，其中來自海洋植物的3.5%具有抗腫瘤活性［1］。我國漫長的海岸線橫跨熱帶、亞熱帶和溫帶，復雜的海域地理環境造就了我國海洋生物的多樣性，為我國天然藥物開發與研究提供極豐富的自然資源。其中滸苔生長迅速，生物量較大，是重要的海洋植物資源。在分類學上，滸苔屬（Enteromorpha）屬于綠藻門（Chlorophyta），石莼目（Ulvales），石莼科（Ulvaceae），主要有條滸苔、扁滸苔、滸苔、腸滸苔及緣管滸苔5種［2］。2008年綠潮藻類曾在我國黃海中、南部海域爆發成災，其實滸苔是具有較高營養價值的藻類資源，其干物質中粗蛋白含量約10%-35%，其中條滸苔、腸滸苔（福建海域）粗蛋白含量約34%；滸苔中必需氨基酸與非必需氨基酸的比值（EAA/NEAA）為0.62，且氨基酸種類齊全，其必需氨基酸（EAA）占氨基酸總量（TAA）約40%，氨基酸評分約80，顯著高于紫菜（54）和海帶（47）［2］，是優質的海洋植物蛋白質來源之一。目前，關于滸苔等多數海藻的研究與開發主要集中在碳水化合物，而對其蛋白質及深加工的研究鮮有報道［3-4］。

天然植物蛋白質除提供能量和氨基酸外，一些來自蛋白質原有序列中的小肽還具有多種生理功能，其不易被消化系統酶系降解，具備口服給藥發揮生理功能的條件［5］。此外，其相比于小分子化學藥物，對目標腫瘤具備高親和力、高特異性、低毒性［6-7］；與抗體藥物相比，免疫原性低、組織滲透性強；還具備良好的溶解性與保濕性，高濃度下黏度低、熱穩定等物理特性，為規?；a提供較好的物理特性基礎［8-9］。酶解蛋白制備活性小肽是當前較為普遍的技術，酶解具有專一性強、條件溫和等優點［10］；研究認為，目前酶法制備獲得小肽的關鍵在于蛋白質的來源、酶的選擇及酶解工藝的優化與控制［11］。目前已從天然蛋白質原有序列中釋放出了如免疫調節肽［12］、降血脂肽［13］、降血壓肽［14］、促鈣吸收肽［15］、抗腫瘤肽［16］、抗菌肽［17］等功能性肽，其中滸苔在食用、醫藥和生物醫學等方面也表現出具有巨大市場潛力和較高的研究價值。

基于此，本研究以條滸苔（福建海域）為原材料，采用特異性蛋白酶酶解制備功能小肽，分離獲得不同分子量區間小肽混合液，以血管內皮細胞（HUVEC）和肺癌細胞（NCI-H446、NCI-H460、A549）為研究對象，體外初步評價酶法制備的條滸苔多肽抗肺癌生物活性。為后續小分子天然活性肽的商業開發、純化與抗腫瘤機制研究奠定基礎，亦為探索條滸苔資源高值化利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

滸苔（干品）由福建福清海興保健食品有限公司提供（福建海域，條滸苔）；木瓜蛋白酶（酶活力：2.0×105U/g）購自南寧龐博生物工程；恒溫振蕩水浴鍋（常州國華電器）；冷凍干燥機（東京理化）；超濾裝置（海濱儀器）；倒置熒光顯微鏡（Nikon TE2000）；流式細胞儀（BD FACS Calibur）；9602G酶標儀（Perlong）；培養瓶、培養板、Transwell（Corning）；Hoechst33342、PI染色試劑盒（碧云天生物技術研究所）；順鉑、MTT、ECM、VEGF均購自Sigma；高糖DMEM、RPMI-1640、M199、胎牛血清（FBS）購自Gibco；RNase A購自上海生工；血管上皮細胞（HUVEC）、肺癌NCI-H460、NCI-H446、A549細胞均來自ATCC細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 滸苔蛋白提取、酶解及超濾分離 滸苔60℃烘干粉碎至180目［18］，采用堿提酸沉法提取滸苔蛋白，并根據預實驗優化的酶解條件：25∶1（W/V）比例加入蒸餾水充分溶脹3 h，調整酶解條件（pH 7.25）后室溫放置穩定1 h，加入1 250 U/g木瓜蛋白酶，45.7℃低速振蕩酶解120 min，90℃滅活15 min，4 000 rpm離心10 min收集上清液，經微孔濾膜（10 μm）微濾去雜質后，依次通過截留分子量為2 kD、6 kD、12 kD的超濾膜分級超濾，獲得多肽各組分凍干備用，根據量效關系預實驗，本研究以實驗終濃度為0.5 mg/mL的各分子量滸苔多肽處理48 h進行分析研究。

1.2.2 細胞增殖實驗 將細胞接種于96孔板（1×105cells/200 μL·孔），待貼壁后，以0.5 mg/mL終濃度的多肽組分II（2 kD＜M＜6 kD）處理細胞（下面細胞處理方法與此相同），設置PBS處理的空白組，設置1 μg/mL順鉑（DDP）處理的陽性組［19］；48 h后MTT法檢測并計算細胞的相對增殖率（Relative grow rate，RGR），每組3個復孔，實驗重復5次。

1.2.3 細胞氧化應激實驗 將HUVEC細胞接種于96孔板（1×105cells /200 μL·孔），待貼壁后，處理同1.2.2，同時設置PBS處理的對照組；37℃、5% CO2培養箱培養48 h后棄培養基，加入DMEM培養基（含10% FBS）稀釋的H2O2至終濃度500 μmol/L，以加入同樣體積的無菌去離子水作為陰性對照計算相對存活率（Relative survival rate，RSR）。每組3個復孔，實驗重復5次。

1.2.4 體外小管形成實驗 在4℃條件下過夜融化ECM，用無血清DMEM按2：1稀釋后，加入96孔板（60 μL/孔），置于37℃培養箱待ECM凝固，每孔加入100 μL 的 HUVEC 細胞懸液（2.5×105cells/mL），細胞處理同1.2.2，同時設置PBS處理的對照組；置于37℃、5% CO2培養箱培養12 h。倒置顯微鏡下隨機取5個視野觀察小管形成情況。每組3個復孔，實驗重復5次。

1.2.5 細胞凋亡實驗 將肺癌細胞接種于96孔板（1×105cells/200 μL·孔），待貼壁后，細胞處理同1.2.2，同時設置PBS處理的對照組，培養48 h后采用Hoechst33342染色法分析腫瘤細胞凋亡情況，在熒光顯微鏡下觀察藍色熒光，每組3個復孔，實驗重復5次。

1.2.6 細胞遷移實驗 在Transwell下室加入500 μL的 M199培 養基（ 含 10 ng/mL VEGF、10% FBS），上室加入100 μL的M199（不含FBS），37℃培養箱內平衡1 h；棄上室培養基，每孔加入100 μL肺癌細胞懸液（2.5×105cells/mL），細胞處理同“細胞增殖實驗”，同時設置PBS處理的對照組；置于培養箱培養18 h，棉簽擦去上室細胞，0.1%結晶紫染色，顯微鏡觀察穿過膜附著在下室的細胞，隨機取5個視野拍照，并用Image J軟件統計細胞個數，計算遷移率。每組3個復孔，實驗重復5次。

1.2.7 細胞周期測定實驗 將肺癌細胞接種于6孔板（1×105cells/2 mL·孔），待貼壁后，處理同1.2.5，同時設置PBS處理的對照組；培養48 h后收集各組細胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，用PBS重復清洗3次后，加入含100 U/mL RNase A的終濃度為5 μg/mL的PI，4℃避光孵育30 min后用流式細胞儀檢測細胞周期過程中各期的細胞相對含量。實驗重復5次。

1.2.8 統計學分析 所有數據采用SPSS19.0軟件分析與處理，計量數據以x-±s表示，組間比較單因素方差分析，P＜0.01表現為顯著差異，P＜0.05表現為差異，均有統計學意義。

2 結果

2.1 滸苔多肽的超濾分離

木瓜蛋白酶在最優條件下酶解條滸苔蛋白質，經超濾得到分子量范圍為：I（M＜2 kD）、II（2 kD＜M＜6 kD）、III（6 kD＜M＜12 kD），各分子量的產物作用濃度0.5 mg/mL，MTT分析抗腫瘤活性。結果（圖1）顯示，與I、III、PBS組相比較，滸苔多肽組分II對上述三種肺癌細胞的RGR最低（P＜0.01），組分II對A549和H446處理組與DDP處理組相比，RGR略低（P＜0.05），組分II對H460處理組與DDP處理組相比，RGR差異不大（P＞0.05）。因此，選取活性組分II（2 kD＜M＜6 kD）進行后續的實驗研究。

圖1 超濾分離不同分子量酶解液對肺癌細胞抑制能力

2.2 滸苔多肽對HUVEC增殖的影響

MTT 檢測結果（圖2）顯示，組分II（0.5 mg/mL）對HUVEC的相對增殖率為83.6%，與PBS組（98.1%）對比差異不大（P＜0.05）。2-6 kD的滸苔多肽對正常細胞HUVEC的抑制作用有限。

2.3 滸苔多肽對小管形成的影響

結果（圖3）顯示，PBS處理組的HUVEC細胞可自行排列，并伸出細絲連接周圍其他細胞形成較多節點，長度較長的管腔結構；組分II（0.5 mg/mL）處理的HUVEC細胞呈散點狀分布，基本不能連接成環，亦不能形成小管。結果表明，2-6kD的滸苔多肽具有抑制小管的形成。

圖2 酶解II組分對HUVECs增殖的影響

n= 5，x-±s. i：PBS；ii：II group

2.4 滸苔多肽抗氧化作用

結果（圖4）所示，組分II（0.5 mg/mL）處理的HUVEC細胞相對存活率為82.1%，與PBS組（41.8%）相比均有極顯著差異（P＜0.01）。結果表明，2-6 kD的滸苔多肽具有抗氧化作用。

圖4 酶解II組分的抗氧化作用

2.5 滸苔多肽對肺癌細胞增殖的影響

結果（圖5）顯示，組分II（0.5 mg/mL）處理的A549、H446、H460肺癌細胞相對增殖率分別為82.8%、61.9%和58.8%，與PBS組比較有顯著差異（P＜0.01）。II處理組中，H446和H460相對增值率顯著低于A549（P＜0.01）。結果表明2-6 kD的滸苔多肽能有效抑制上述3種肺癌細胞的增殖，且對H446、H460的抑制效果好于A549。

圖5 酶解II組分對肺癌增殖的影響

2.6 滸苔多肽對肺癌細胞遷移的影響

結晶紫染色觀察結果顯示（圖6-A），組分II（0.5 mg/mL）處理的三種肺癌細胞遷移數量顯著少于PBS組。統計分析表明（圖6-B），組分II處理的3種肺癌細胞遷移率與PBS組比較顯著差異（P＜0.01）；II處理組中，H446和H460的遷移率顯著低于A549遷移率（P＜0.01）。結果表明，2-6 kD的滸苔多肽能夠有效抑制上述3種肺癌細胞的遷移，且對H446、H460的遷移抑制強于A549。

2.7 滸苔多肽對肺癌細胞凋亡的影響

熒光顯微鏡觀察Hoechst33342染色的結果（圖7）所示，PBS處理組的腫瘤細胞呈現弱藍色熒光；組分II處理的A549、H446、H460肺癌細胞組出現大量凋亡，細胞核呈現強藍色熒光；組分II處理組中，H446和H460比A549凋亡更多。結果表明2-6 kD的滸苔多肽能有效誘導上述3種肺癌細胞的凋亡。

2.8 滸苔酶解多肽對肺癌細胞周期的影響

圖6 酶解II組分對肺癌細胞遷移的影響

圖7 酶解II組分對肺癌細胞凋亡的影響

流式細胞儀對滸苔多肽處理的A549、H446、H460細胞周期時相的時間動力學分析結果（圖8-A）顯示，所有圖中均存在一個較大的碎片峰（圖中藍色部分），可能由于滸苔多肽的作用，導致肺癌細胞膜與胞內物質出現分離，在反復吹打回收細胞時導致部分細胞破裂。G2/M期細胞數統計結果（圖8-B）所示，組分II處理的A549、H446、H460肺癌細胞，G2/M期肺癌細胞所占比例分別為13.3%、20.3%和20.8%，顯著高于PBS組（P＜0.01），且 II處理組H446、H460的G2/M期所占比例與A549也有顯著差異（P＜0.01）。結果表明2-6 kD的滸苔多肽能阻滯肺癌細胞周期于G2/M期。

圖8 酶解II組分對肺癌細胞周期的影響

3 討論

目前，隨著制藥技術的更新換代，人們對天然活性小肽的認識不斷加深，相對于其他的給藥途徑，天然小肽類藥物的經鼻、肺部或口服等給藥途徑表現出更具可行性及商業價值［19-20］。天然植物蛋白質釋放的小肽是近幾年抗腫瘤新型藥物的研究熱點，其中滸苔屬的小分子肽藥用研發價值已逐漸被人發掘［21］，本研究為條滸苔蛋白質資源高值化利用（功能食品、保健飲料、肽類藥物等商業開發）探索提供新的途徑。本文充分利用滸苔藻類資源豐富的優勢，在前人的研究基礎上，通過大量酶解條滸苔蛋白以篩選更多的抗腫瘤活性多肽。研究結果表現為：（1）經木瓜蛋白酶解的小于2 kD和6-12 kD條滸苔多肽對三種肺癌細胞未有明顯的抑制作用；其2-6 kD條滸苔多肽對小管形成有一定抑制作用，說明其有抗血管生成能力，間接抑制腫瘤細胞的轉移，但其對HUVEC的增殖抑制作用不強，說明其對正常細胞的損害不大；（2）2-6 kD條滸苔多肽可抑制H2O2引起的氧化應激，說明其具有一定的抗氧化能力，該結果與氧化應激是腫瘤一個重要的誘發因素和病理特征的研究結論是一致的［22-23］；（3）2-6 kD條滸苔多肽對三種肺癌抑制增殖、促進凋亡、細胞周期阻滯等具有一定的作用效果，表明其有一定的抗肺癌能力；細胞周期的實驗結果與目前發現的一些多肽抗腫瘤研究結果一致［24-25］，其作用機制還有待進一步研究；（4）2-6 kD條滸苔多肽抑制H446、H460增殖與遷移、促進凋亡、細胞周期阻滯等作用均表現強于對A549細胞的作用，推測可能對小細胞肺癌模型（H446、H460）和非小細胞肺癌模型（A549）的作用機制不同，仍有待進一步研究。

4 結論

經初步篩選及評價，本研究以木瓜蛋白酶最佳酶解條件：料液比1∶25、加酶量1250 U/g pro、溫度45.7℃、pH 7.2、震蕩酶解時間120 min，酶解條滸苔蛋白獲得的2-6 kD的多肽混合液，通過對三種肺癌細胞（A549、H446、H460）和HUVEC處理作用，表明該分子量范圍內的多肽混合液中，存在能一定程度抑制小管形成及抗氧化作用，和抑制肺癌細胞增殖、促進凋亡、阻滯細胞周期等作用的小分子多肽，且其抑制H446、H460增殖與遷移、促進凋亡、細胞周期阻滯等作用均表現強于對A549細胞的作用。本課題組下一步將進一步縮小范圍，分離純化解析活性多肽組成，并開展機制和動物實驗研究。