米曲霉功能基因組研究策略和進展

吳琴琴 孫敏 陳雨 付雅琴 曾斌 賀斌

（江西科技師范大學生命科學學院，南昌 330013）

米曲霉（Aspergillus oryzae）是我國傳統釀造行業的優良菌種，在醬油釀制、豆豉制作等方面都有著廣泛應用［1］。同時，米曲霉又是公認的食品安全生產菌株，發酵及后處理技術成熟，因此它除了在傳統發酵工業中被用于生產醬油、豆豉產品外，還常用于生產初級、次級代謝產物及酶類產品，同時也是基因表達和蛋白分泌研究的理想對象［2-3］。

隨著二代測序技術的發展，基因組測序已經變得越來越普遍，相對于植物和動物，真菌基因組小，容易被測序和注釋，因此成為生物基因組研究的典型例子，為功能基因組、表達調控機理和物種進化奠定了理論基礎。2005年，日本26家科研單位利用鳥槍法共同完成了世界首例米曲霉RIB40的基因組測序工作［4］。米曲霉基因組大小為37 Mb，共8條染色體，包含12 074個基因。相比構巢曲霉和煙曲霉，米曲霉基因組分別比兩者大29%和34%，這些米曲霉特有的基因主要和水解酶分泌、氨基酸代謝和糖類轉運相關。隨后，更多的米曲霉菌株被測序，截至目前，共有10株米曲霉完成測序，基因組大小從35.43 Mb到41.16 Mb，GC含量大致為47%-48%（表1）。雖然米曲霉的基因組已經被破譯，但是對米曲霉的功能基因組研究進展緩慢，米曲霉 RIB40基因組中預測的編碼蛋白基因是12 074個，其中僅有205個基因功能經過驗證，占基因總數的1.7%［5］。究其原因，一是因為可用的篩選標記少，米曲霉對常見的抗生素具有較強的抗性，如氨芐霉素（Amp）、卡那霉素（Kana）、頭孢霉素（Ca）等，同時某些合成抗生素的基因可能會向環境及其他微生物中轉移，而米曲霉又常用于食品生產，因此美國FDA已禁止在食品中使用這類標記；另外一個原因是轉化子的不穩定性，因為米曲霉在繁殖過程中存在多核現象，很難篩選到純化的轉化子。

表1 已完成基因組測序的米曲霉菌株

1 米曲霉功能基因組研究方法

1.1 篩選標記

有效的篩選標記是功能基因組研究的基礎，它可以降低假陽性率，減少篩選工作量。目前米曲霉轉化載體常用的篩選標記有抗藥性標記和營養缺陷型標記基因。

1.1.1 抗藥性標記 抗藥性篩選標記不要求受體菌具有營養缺陷型，可以作為顯性篩選標記，是真菌遺傳轉化應用最為廣泛的標記。抗藥性基因轉入受體菌后，可使受體菌在一定藥物濃度下生長，表現出藥物抗性。潮霉素B抗性基因，如hph，hygr等，是真菌遺傳轉化系統中應用最為廣泛的抗藥性標記。Fernandez等［13］將潮霉素B抗性基因hph作為篩選標記，成功構建了米曲霉的干擾載體，并抑制了米曲霉與孢子顏色相關基因wA的表達；郭繼平等［14］將潮霉素B抗性基因（hygr）的置換型打靶載體pHC2，將其線性化后轉化米曲霉，成功得到了米曲霉的抗潮霉素菌株。除此以外，博來霉素抗性基因，如ZeoR，也被用作米曲霉遺傳轉化的篩選標記。尹燕辰等［15］使用pBC-hygro作為質粒骨架，并進行了改進和優化，成功獲得米曲霉的抗博來霉素菌株，并以此菌株為基礎，表達米曲霉α-淀粉酶同源基因amyB，成功獲得酶活提高106.27%的轉化子。由于米曲霉對多種藥物具有抗性，因此目前報道的抗藥性篩選標記較少，主要有bar、sull、bs、km等。使用抗藥性篩選標記的轉化體系大多都需要使用抗生素，價格昂貴，且某些合成抗生素的基因可能會向環境及其他微生物中轉移，而米曲霉又常用于食品生產，因此美國FDA已禁止在食品中使用這類標記。

1.1.2 營養缺陷型標記 營養缺陷型標記可以通過轉入標記基因，從而與受體細胞突變基因互補，從而使受體細胞可以和野生型一樣的表型。pyrG是米曲霉轉化中用的最多的一種營養缺陷型標記，其原理是pyrG編碼的乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶可以將5-氟乳清酸（5-FOA）催化為5-氟乳清苷酸（5-FUMP），而5-FUMP具有很強的細胞毒性，使得野生型菌株在含有5-FOA的平板上不能生長，而pyrG基因突變菌株失去了催化活性，從而可以在含有5-FOA的平板上生長。Yasuda等［16］以工業上常用的米曲霉菌株KBN出發，用pyrG作為篩選標記，成功構建了高效的基因敲除體系。Jun-Ichi等［17］以pyrG基因突變菌株為受體菌，建立了多基因缺失體系，同時敲除了2個蛋白酶表達相關的基因。Jaewoo等［18］利用該系統，實現了一個載體敲除多個基因。我國醬油、豆豉等發酵過程中大多選用米曲霉3042作為發酵菌株，該菌株尚未構建便于遺傳操作的轉化載體，本課題組前期基于RIB40的轉化載體，成功構建了米曲霉3042菌株的pyrG突變的轉化載體，并成功進行了轉化，為改良菌株性能和提高醬油品質奠定了基礎［19］。除此以外，米曲霉轉化常用的營養缺陷型標記還有編碼硝酸鹽還原酶的niaD基因，編碼色氨酸生物合成酶的trp基因等。niaD編碼的硝酸鹽還原酶是真菌氮素代謝過程中的關鍵酶，可使轉化子獲得硝酸鹽代謝能力，但niaD功能缺失的突變株能耐受高濃度的氯酸鹽，而野生型則不能；trp基因是色氨酸合成的關鍵基因，而色氨酸是米曲霉生長的必需氨基酸之一，trp功能缺失的突變株不能正常合成色氨酸，導致色氨酸營養缺陷，即在色氨酸缺陷培養基內不能生長。營養缺陷型標記獲得的轉化子篩選便捷，只需要用基礎培養基來篩選，無需添加抗生素等，同時可以用于不同真菌之間的轉化。但是缺點在于絲狀真菌大多具有多核現象，用這種方法分離純合子比較困難。

1.2 轉化方法

高效的遺傳轉化體系是米曲霉功能基因組研究的前提，相對于其他微生物而言，如酵母和大腸桿菌，米曲霉存在著堅韌的細胞壁，所以轉化效率低下。為提高遺傳轉化效率，現有多種轉化方法，主要包括原生質體法-PEG/CaCl2、農桿菌介導法和電擊轉化法。

1.2.1 原生質體法-PEG/CaCl2PEG/CaCl2介導的遺傳轉化是使用較早較普遍的細胞融合方法。1978年，Hinnen等［20］首先利用聚乙二醇（PEG）作為介質成功完成了酵母原生質體轉化，此后PEG介導的原生質體轉化法逐漸應用于粗糙鏈孢菌（Neurospora crassa）和構巢曲霉（Aspergillus nidulans）等，使這一技術得到廣泛的應用。PEG/CaCl2是以原生質體作為感受態細胞，將所轉化DNA和原生質體混合后，在含有一定濃度 CaC12和PEG等堿性環境下進行的。

PEG是一種能夠促進原生質體吸收外源DNA的化學誘導劑，在高pH環境可以通過電荷間的相互作用與外源DNA形成緊密復合物，原生質體通過內吞作用將這些復合物吸收至細胞內，隨后再進入細胞核并整合到受體基因組中［21］。在轉化過程中，可用于制備原生質體的絲狀真菌出發材料有多種選擇，如無性孢子、新鮮菌絲體或者擔孢子［22］。PEG轉化方法的優點是受體細胞數量大，容易獲得純合型的轉化子，效率高、整合度和遺傳性高等，因此原生質體融合在米曲霉遺傳轉化中應用廣泛［23］。韓志雙等［24］通過PEG/CaCl2介導的原生質體法選育出2株米曲霉酸性蛋白酶高產菌株。劉肖凱［25］也用該方法敲除了米曲霉4177中Rho GTPase家族中的6個成員，并獲得了相應表型的突變菌株。同時，原生質體法也存在一些缺陷，如培養難度大，再生頻率低和周期長，并且價格昂貴，不易獲得轉化體以及轉化受體細胞。

1.2.2 農桿菌介導法 農桿菌介導轉化法（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation，ATMT）是通過根癌農桿菌將外源 DNA 轉入植物、細菌和真菌細胞內［26］，在1995年Bundock等［27］首次成功進行了根癌農桿菌介導酵母菌的遺傳轉化。在此之后，科學家們相繼對絲狀真菌的轉化方法加以重視。根癌農桿菌介導的轉化技術為絲狀真菌功能基因組的研究奠定了基礎，遺傳轉化技術現在已經比較成熟，很多結果表明也都成功獲得轉化子［28-29］，但是由于米曲霉的多耐藥性，因此該方法在米曲霉中的應用目前在國內尚未見報道。而在2016年，Nguyen等［30］利用pyrG作為篩選標記首次將農桿菌介導轉化法應用在米曲霉中，并與綠色熒光蛋白GFP融合，成功構建了米曲霉的農桿菌介導轉化的過表達體系。隨后，在2017年，該作者通過改造該載體，利用同源重組的原理，通過農桿菌介導轉化成功構建了米曲霉RIB40的敲除體系［31］。農桿菌介導的米曲霉轉化體系的確立，克服了原有轉化體系操作繁雜、轉化效率低、耗時多等缺點，將成為一種主流的轉化系統。但本課題組在利用農桿菌介導法轉化米曲霉時發現，通過這種方法獲得的轉化子不穩定，因為米曲霉大多具有多核現象，在傳代過程中個別核很容易丟失，因此很難篩選到純合子。劉雪［22］通過多輪過濾的方式，大大提高了單核孢子的比例。因此，通過農桿菌轉化篩選轉化子時，可以通過多輪富集和篩選的方法，將單核孢子從轉化子中篩選出來，本課題組利用膜過濾的方法，將單核孢子的比例從11%提高到30%，提高了純合子篩選概率［19，32］。

1.2.3 電擊轉化法 電擊轉化法是將原生質體或細胞質膜在高壓脈沖作用下，形成瞬間通道，將外源吸收至細胞內部，由于質膜可以進行自我修復，從而修復高電壓脈沖造成的穿孔。雖然電擊轉化步驟簡單，但是轉化效率較低。陳鳳等［33］研究表明，在多次電擊轉化米曲霉 niaD300時，未將基因成功轉進米曲霉中。同時，電擊法轉化米曲霉價格昂貴，且轉化前還需對電擊參數進行探索，相對比較繁瑣，因此電擊轉化法在米曲霉功能基因組研究過程中應用較少。

1.3 遺傳操作

有效的篩選標記和高效的轉化方法是遺傳操作的前提，也是功能基因組研究的基礎。由于篩選標記的限制和轉化體系的不成熟，傳統的遺傳操作（如同源重組、誘導突變等），相對于酵母和構巢曲霉，在米曲霉中報道較少。近年來，CRISPR/Cas9技術由于其高效性，已經快速應用在多個物種當中，但是在米曲霉中僅有2篇文獻報道。2015年，Katayama等在米曲霉中首次建立了CRISPR/Cas9系統，并成功敲除了wA，pygG和yA基因，突變率在10%-20%之間［34］；隨后該課題組在2018年進一步改良了CRISPR/Cas9系統，在米曲霉中的敲除效率達到了50%-100%，并實現了多基因同步敲除［35］。

2 米曲霉功能基因組研究進展

2.1 分生孢子

米曲霉作為形態結構高度復雜的微生物，發揮著越來越大的應用價值和潛力，它會在生命周期呈現出不同的生命狀態，米曲霉的分生孢子是由一個特殊的發育營養結構而形成的，被稱作菌絲梗［36］。菌絲梗在一定時期形成基地菌絲體上的足細胞，然后在生長發育成囊泡，囊泡出芽形成瓶梗，接著分生孢子形成在瓶梗表面。在分生孢子的形成過程中受到多個基因的調控。brlA基因的激活是曲霉分生孢子形成最基本的步驟，brlA通過控制早期的發育調控基因abaA、rodA和yA的表達調控分生孢子的表達，使其正常的分化；在中期，BrlA蛋白激活abaA基因，abaA基因與AbaA 結合，控制著發育基因的表達；在后期，wetA基因受 AbaA 蛋白誘導激活，brlA、abaA和wetA這三個基因決定基因激活的順序［37-38］。另外，有研究表明白光可以通過下調brlA的表達而抑制分生孢子的產生，這個現象與其他曲霉屬物種相反［39］。隨著生物信息學、基因組學和分子生物學等的快速發展，米曲霉產孢機制及相關基因的研究將更加深入。

2.2 蛋白分泌和表達

米曲霉作為發酵工業重要的菌株，具有強大的蛋白分泌能力。Liu等［40］對米曲霉基因組通過文獻總結和生物信息學分析，共鑒定米曲霉中369個分泌蛋白，與此同時還發現米曲霉相對于植物和哺乳動物具有較強的蛋白質分泌、合成能力以及快速生長，易培養等優點，與大腸桿菌和酵母相比也具有強大的翻譯后修飾功能［41］。正是由于米曲霉的這些特點，米曲霉異源蛋白的表達，現今成為一個熱點話題，已有很多方法提高異源蛋白的產量，如提高基因拷貝數、使用強啟動子、基因融合、蛋白酶缺陷株、優化培養條件等［42］。Jin等［43］通過UV定向變異和選擇標記性基因敲除技術，構建了米曲霉的多重營養缺陷型菌株，并通過構建酸性蛋白酶PepE和三肽酶TppA雙基因敲除菌株來表達外源人溶菌酶（Human lysozyme，HLY）基因，使酶產量提高20倍以上。Wang等［44］利用基因重組等技術獲得突變體菌株 RIII-7，高果糖基轉移酶（FTase）活性180 Ug-1是原始菌株的2倍，在發酵培養中，達到最大值353 U/g。雖然米曲霉具有強大的蛋白分泌能力，可作為理想的外源蛋白表達宿主，但由于米曲霉復雜的蛋白酶系和自噬系統，使得外源蛋白的表達產物難以積累和分泌，另外外源基因在轉錄過程中，會受多個轉錄因子調控，因此米曲霉蛋白分泌和表達的分子機制研究還有待加深，以實現米曲霉生產外源蛋白的工業化。

2.3 次級代謝產物

米曲霉不但有較強的分泌蛋白的能力，而且還有豐富的次生代謝產物。聶麗娟［45］在米曲霉中分離得到近20余種化合物，其中包括10余種小分子藥理活性物質，如抗真菌的Asperfuran，抗高血壓的Mutaaspergillic acid等，也包含一些真菌毒素，如圓弧偶氮酸（Cyclopiazonic acid），曲酸（Kojic acid）等；Marui等［46］通過基因組比較發現，在米曲霉中保留有生產青霉素的基因簇，而且保持非常高度的完整性，但產量極低。通過人為調控基因的高效表達，使青霉素的產量提高了100倍。另外，雖然米曲霉在基因組上接近黃曲霉，但米曲霉不會產生黃曲霉毒素。Zhang等［47］報道了米曲霉的黃曲霉毒素生物合成基因簇的同系物，甚至在有利于黃曲霉和寄生曲霉的黃曲霉毒素表達條件下也不會表達，其原因是米曲霉缺少aflR基因，正是因為這種特性使得米曲霉可以用在食品工藝上。另外，常用于化妝品和食品加工領域的曲酸也是米曲霉的主要次級代謝產物之一。曲酸的合成依賴于米曲霉基因簇上的14個基因，從AO090113000132到AO090113000145，其中包含3個關鍵基因：kojR、kojA和kojT。

隨著米曲霉功能基因組的迅速發展，很多研究者利用基因工程和代謝工程來提高米曲霉的次級代謝產物的產量。Li等［48］通過過表達米曲霉脂肪酸去飽和酶基因D9D，發現米曲霉在提高不飽和脂肪酸含量的同時也可以提高其耐鹽性。Knuf等［49］敲除了米曲霉中乳酸脫氫酶基因以提高乳酸產量，該工程菌在以淀粉為基質的培養基中乳酸產量可達30 g/L。雖然米曲霉中被鑒定的次級代謝產物種類在逐漸增加，但是合成這些次級代謝產物的基因簇和相關基因卻報道甚少。對于米曲霉發酵和蛋白分泌上的優勢，是否能通過代謝工程用米曲霉大規模生產藥物先導化合物或者通過基因工程手段提高有用次級代謝產物的產量？對于米曲霉的安全性，在一些特定環境中米曲霉是否會產生污染食品的真菌毒素？這些問題都值得重視并且進行深入的研究。

3 展望

米曲霉作為食品工業生產的一類重要微生物，主要應用于傳統釀造行業。同時，米曲霉強大的蛋白分泌能力使其在酶制劑和重組蛋白等行業也應用廣泛，而其豐富的次級代謝產物使米曲霉具有藥物先導化合物優質來源的潛力。隨著米曲霉功能基因組學研究的不斷深入，最終將從分子、進化和生產各層面闡述重要基因的生物學功能，揭示米曲霉蛋白分泌和表達、次級代謝產物合成的分子機理，最終為工業生產提高效率和質量。應用基因工程對米曲霉菌株的改造和代謝工程對米曲霉發酵的優化，還需要更深入和廣泛的研究：開發更多的安全篩選標記，保證發酵食品的安全性；多種轉化方法相結合，提高遺傳轉化效率；探討不同條件下米曲霉的代謝物變化，提高米曲霉發酵效率和控制發酵過程中的真菌毒素；深入研究米曲霉次級代謝產物合成相關的基因簇，開發藥物前體的新來源。米曲霉功能基因組的研究成果將為提高米曲霉的發酵效率、保證米曲霉發酵食品的安全性和擴大米曲霉在工業上的應用范圍奠定基礎。