豬圓環病毒2型Cap蛋白多克隆抗體的制備及鑒定

歐云文 代軍飛 馬炳 張杰 鄧輝祥 李瀟 張欣明

（1. 中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州730046；2. 開江縣動物疫病預防控制中心，達州 636250）

豬 圓 環 病 毒 2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）屬于無囊膜的、單股、環狀、負鏈 DNA病毒，是已知最小的動物病毒之一，是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）、皮炎和腎病綜合征（PNDS）的主要病原［1］。豬感染PCV2后，機體發生免疫抑制，進而出現免疫缺陷，淋巴細胞缺失，以及淋巴組織中巨噬細胞浸潤等與PMWS相關的病理特征，主要在呼吸、泌尿、腸道、淋巴、心血管、神經、生殖和被膜系統上表現出臨床癥狀［2-3］。PCV主要分為3個基因型，即PCV1、PCV2和PCV3。有研究表明，PCV1與PCV2基因序列的同源性小于80%，但是PCV1毒株間基因序列的同源性大于99%，PCV2毒株間基因序列的同源性大于96%。2016年，美國學者Phan等［4］首次從豬心臟等樣品中分離出 PCV3，通過宏基因組測序發現其為一種先前未知的新型豬圓環病毒（即豬圓環病毒3型，PCV3）。PCV2作為豬圓環病毒家族中非常重要的成員，也是豬群中最常見的豬圓環病毒基因型，于1991年在加拿大首次被發現［1］。在臨床病例中，PCV2常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細小病毒（PPV）、豬偽狂犬病毒（PRV）等繁殖障礙性病原混合感染，出現母豬流產、產木乃伊胎等臨床癥狀，嚴重影響全球養豬業持續健康發展［5］。

PCV2為二十面體對稱病毒，基因組大小約為1 760 bp，包括11個開放性閱讀框（ORFs），其中ORF1和ORF2為兩個主要的 ORF［6］，ORF1作為PCV2最大的ORF，主要編碼病毒復制蛋白，即Rep蛋白，不同毒株間ORF1基因編碼蛋白序列的同源性大于86%［7］。ORF3被ORF1所包含，但轉錄方向與ORF1相反，其編碼一種誘導宿主細胞凋亡的病毒非結構蛋白［8］。Cap蛋白由ORF2基因編碼，分子量大小約27. 8 kD，由233-234個氨基酸構成，PCV1與PCV2的Cap蛋白同源性較低，而PCV1或PCV2分離毒株間Cap蛋白同源性則較高。Cap蛋白N端富含堿性氨基酸，序列高度保守，前41個氨基酸是Cap蛋白的核定位信號肽序列，其中第12-18位和第34-41位氨基酸對于Cap蛋白的核定位起著決定性作用。第69-83位和第117-131位氨基酸作為Cap蛋白的兩個主要特異性抗原表位，其中第117-131位（B-133）表位可作為PCV2感染的血清學標記，用于檢測PCV2抗體效價。Cap蛋白作為PCV2主要的結構蛋白和免疫相關蛋白，在PCV2的感染和機體免疫過程中起著重要作用［9-10］。鑒于此，Cap蛋白常作為PCV2的靶蛋白應用于疫苗和診斷方法的研究［11-13］。有學者采用原核表達PCV2重組Cap蛋白，并以純化后重組Cap蛋白為免疫原五次免疫產蛋雞，制備抗Cap蛋白的多克隆抗體IgY，研制PCV2 Cap蛋白檢測試劑盒［14］。本研究以豬圓環病毒2型Cap蛋白編碼基因為參考序列，以PCV2毒株（CAU0673）基因為模板，設計特異性引物，進行Cap蛋白的誘導表達，Ni-NTA樹脂親和層析純化和復性；復性后的重組Cap蛋白與弗氏佐劑混勻乳化，經背部皮下多點注射4次，免疫新西蘭大耳白兔，制備兔抗Cap蛋白多克隆抗體，為PCV2抗體檢測方法的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

pET30a（+）載體購于Novagen公司；Ni-NTA樹脂購于QIAGEN公司；PCV2毒株（CAU0673）、PCV2陽性豬血清購于中國獸醫藥品監察所；Trans109和BL21（DE3）感受態由家畜疫病病原生物學國家重點實驗室抗體工程課題組保存；DNA Marker、蛋白Marker、BamH I和XhoI限制性酶購于寶生物工程（大連）有限公司；質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒和PCR清潔試劑盒購于AxyPrep公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖甘（IPTG）、辣根過氧化物酶（HRP）標記兔抗豬IgG、HRP標記羊抗兔IgG和FITC標記的羊抗兔IgG購于SIGMA公司；蛋白胨、酵母提取物購于OXOID公司；卡那霉素購于Hyclone公司；豬圓環病毒2型滅活疫苗分別購于上海海利生物技術股份有限公司、普萊柯生物工程股份有限公司；普通級新西蘭大白兔購于中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心；其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 pET30a-PCV2-Cap重組載體的構建與鑒定以Cap蛋白編碼基因為參考序列（GenBank：DQ-235696），進行引物設計。上游引物P1：5'-CGCGG ATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTC-3'，劃下橫線處為BamH I限制性酶切位點；下游引物P2：5'-CCGCTCGAGTCTTAGGGTTAAGTGGGGGGTCT TT-3'，劃下橫線處為XhoI限制性酶切位點，引物由Invitrogen（上海）公司合成。以PCV2毒株（CAU0673）基因為模板，PCR擴增，獲取目的基因片段。采用BamH I和XhoI雙酶切pET30a（+）載體和DNA擴增產物，酶切產物經T4酶16℃連接18 h，將成功構建的pET30a-PCV2-Cap重組質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，涂布于卡那霉素抗性的LA平板，37℃培養12 h。挑取單菌落200 r/min搖菌培養，離心收菌，提取質粒，對重組質粒分別進行PCR鑒定和BamH I、XhoI雙酶切鑒定，并送GENEWIZ（金唯智）公司測序。

1.2.2 重組Cap蛋白表達、純化、復性及鑒定 優化誘導表達條件，將鑒定完畢的重組表達菌接種于LB培養液，在終濃度為1 mmol/L IPTG 37℃誘導表達6 h，12 000 r/min離心收菌，PBS液懸浮洗滌，300 W超聲破碎，8 000 r/min離心分離裂解液和沉淀，SDS-PAGE電泳分析。采用不同pH值的親和層析液對重組Cap蛋白進行Ni-NTA親和層析純化，層析液包括：洗滌緩沖液（pH8.0）、2 mol/L尿素和B緩沖液（pH8.0），將溶解后樣品與Ni- NTA樹脂柱26℃結合40 min，采用C緩沖液（pH6.3）、D緩沖液（pH5.9）、E緩沖液（pH4.5）洗脫、收集樣品，再采用不同濃度梯度的尿素（即8 mol/L、4 mol/L、2 mol/L、1 mol/L）和PBS液透析復性純化后的重組Cap蛋白，最后進行SDS-PAGE分析。將純化的復性重組Cap蛋白轉印至PVDF膜，先后進行5%脫脂奶粉室溫封閉，PCV2陽性豬血清（稀釋比例為1∶100）室溫搖床孵育，PBST緩沖液洗滌，HRP標記兔抗豬IgG（稀釋比例為1∶5 000）室溫搖床孵育，PBST緩沖液洗滌，HRP-DAB底物顯色，暗室中曝光等操作步驟，對重組Cap蛋白進行Western blot鑒定。

1.2.3 多克隆抗體的制備 選取12只健康、大小相近的雄性新西蘭大耳白兔，分為4組，每組3只，分別為PCV2（LG毒株）滅活疫苗組（海利）、PCV2（SH毒株）滅活疫苗組（普萊柯）、PCV2重組Cap蛋白抗原組和陰性對照組（PBS液）。免疫原經背部多點皮下注射，按基礎免疫和加強免疫兩個階段進行，海利組、中牧組基礎免疫劑量為0.5豬劑量/只，加強免疫劑量為1頭份/只，總共免疫4次，每次間隔時間為14 d。重組Cap蛋白組基礎免疫時，采用重組Cap蛋白與完全弗氏佐劑等體積混勻乳化，免疫劑量為200 μg /只；加強免疫時，采用重組Cap蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻乳化，免疫劑量為400 μg /只，總共免疫4次，每次間隔時間為14 d；陰性對照組按照同樣方法進行皮下注射（表1）。每次免疫前，耳緣靜脈采血1-2 mL，最后一次加強免疫后7 d，頸動脈放血，3 000 r/min離心分離血清，-20℃保存。

表1 動物分組及免疫程序

1.2.4 多克隆抗體的鑒定

1.2.4.1 反應原性鑒定 PCV2全病毒蛋白、重組Cap蛋白和pET30a空載體經SDS-PAGE分離后，轉印至PVDF膜，以制備的Cap蛋白多克隆抗血清（稀釋比例為1∶1 000）作為一抗，以辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG（稀釋比例為1∶5 000）作為二抗，進行Western blot反應，鑒定多克隆抗體的反應原性，其他反應條件同1.2.2。

1.2.4.2 抗體效價測定 采用本實驗室已建立的間接ELISA方法對免疫兔血清抗體效價進行檢測，將重組Cap蛋白以100 mL/孔包被于96孔的聚苯乙烯ELISA板，按照1/200、1/400、1/800、1/1 600、1/3 200、1/6 400、1/1 2 800、1/2 5 600倍比梯度稀釋待檢免疫兔血清，待檢樣品為每試驗組免疫后0 d、14 d、28 d、42 d、56 d的兔血清。操作步驟如下：加待檢樣品100 μL/孔，未免疫兔血清為陰性對照，37℃孵育 0.5 h，洗滌液洗板3次；加辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG（稀釋比例為1∶7 000）100 μL/孔，37℃孵育 0.5 h，洗滌液洗板3次；加 TMB顯色液100 μL/孔，室溫避光孵育20 min，終止液終止反應，酶標儀讀取OD450值，若待檢樣OD450值≥2.1倍陰性對照樣OD450值，則判為是PCV2抗體陽性。

1.2.4.3 間接免疫熒光檢測 將PCV2毒株（CAU0673）接種于單層培養的PK-15細胞，37℃、5% CO2條件下培養48 h，采用4%多聚甲醛4℃固定接毒后的PK-15細胞30 min，PBS液洗滌3次，5 min/次，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h；分別將四種免疫原制備的多克隆抗血清和非免疫兔血清作為一抗，3%BSA為稀釋液，稀釋比例為1∶100，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，5 min/次；以FITC標記的羊抗兔IgG為二抗，PBST為稀釋液，稀釋比為1：300，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，5 min/次，最后加PBS覆蓋封片，于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 pET30a-PCV2-Cap重組載體的構建結果

以PCV2毒株（CAU0673）的基因為模板，P1、P2為引物，擴增獲得1條大小約702 bp的目的片段，而陰性對照組無目的片段（圖1），與預期結果相符合。構建的pET30a-PCV2-Cap重組質粒經BamH I、XhoI酶切鑒定，在702 bp和5 422 bp處出現目的基因片段的pET30a（+）載體片段（圖2）。

圖1 PCV2-Cap片段PCR擴增

2.2 重組Cap蛋白表達、純化、復性及鑒定結果

重組表達菌BL21（DE3）在最適宜條件下誘導表達，經SDS-PAGE電泳分析，在34 kD處出現目的條帶，與理論值相一致，同時發現目的蛋白主要以包涵體形式存在（圖3）。復性后重組Cap蛋白轉印至PVDF膜，進行Western blot鑒定，試驗結果（圖4）顯示，在34 kD處出現特異性的顯色條帶，而pET30a空載體處無特異性條帶。這表明重組Cap蛋白與PCV2陽性豬血清發生特異性反應，擁有良好的反應原性。

圖2 重組質粒的酶切鑒定

圖3 重組Cap蛋白SDS-PAGE分析

圖4 重組Cap蛋白Western blot分析

2.3 多克隆抗體鑒定結果

2.3.1 反應原性鑒定結果 Western blot鑒定結果（圖5）顯示，重組Cap蛋白免疫制備的兔多克隆抗體與PCV2全病毒蛋白、重組Cap蛋白均發生特異性反應，在34 kD處出現特異性目的條帶，而pET30a空載體處無特異性的目的條帶，陰性對照兔血清與PCV2全病毒蛋白、重組Cap蛋白均未發生特異性反應，表明制備的多克隆抗體具有良好的反應原性。

圖5 兔抗血清的Western blot分析

2.3.2 抗體效價檢測結果 經間接ELISA檢測表明，采用重組Cap蛋白制備的多克隆抗體的抗體效價顯著高于兩種商品化的疫苗組，海利組抗體效價為1∶3 200，普萊柯組抗體效價為1∶1 600，而重組Cap蛋白組抗體效價為1∶12 800（圖6）。

圖6 兔血清的抗體效價

2.3.3 間接免疫熒光檢測結果 重組Cap蛋白制備的多克隆抗體與PCV2全病毒抗原發生特異反應，在熒光顯微鏡下觀察可見熒光（圖7-B）；而陰性對照組（PBS液作為免疫原）未出現熒光（圖7-A）。

圖7 多克隆抗體的間接免疫熒光檢測

3 討論

PCV2作為目前已知最小的動物病毒，是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的重要病原。PCV2編碼的Cap蛋白通過干擾素調節因子3（IRF3）與核轉錄因子кB（NF-кB）抑制干擾素，Rep蛋白則通過NF-кB激活干擾素，兩者在調控方面表現出相反的功能，進而影響宿主先天性免疫反應［15］。Cap蛋白作為PCV2的主要結構蛋白，常用于PCV2疫苗和診斷方法的研究。有學者［16］將缺少N端核定位信號的Cap蛋白基因分成7個連續重疊的DNA片段Cap（1-7），采用細菌展示載體系統（APEx）對Cap蛋白上的抗原表位進行深入研究，發現Cap6是Cap蛋白上的抗原優勢區域，Cap6-2為抗原優勢表位，為PCV2血清學診斷和抗原檢測奠定了基礎。目前，有學者采用桿狀病毒系統、枯草芽孢桿菌等對Cap蛋白進行表達研究［17-18］。

本研究通過PCR擴增Cap蛋白編碼基因，成功構建pET30a-PCV2-Cap重組載體，在BL（DE3）宿主菌中IPTG誘導表達，得到大小約為34 kD的重組Cap蛋白，并發現Cap蛋白以包涵體形式表達，該存在形式有效避免了重組Cap蛋白被蛋白酶所降解。充分利用載體自帶的His標簽，通過Ni-NTA樹脂親和層析純化，得到高純度的目的重組蛋白。重組Cap蛋白與PCV2陽性豬血清發生特異性反應，表明該重組Cap蛋白具有很好的反應原性和特異性。復性后的重組Cap蛋白與弗氏佐劑混勻乳化，經背部多點免疫新西蘭大耳白兔，制備兔抗Cap蛋白多克隆抗體，并同時采用兩種不同廠家的商品化疫苗進行平行試驗。結果發現Cap蛋白免疫的兔抗血清特異性良好，與PCV2重組Cap蛋白和全病毒抗原均發生特異性反應。重組Cap蛋白組與兩家商品化疫苗組相比，其抗體效價高，達到1∶12 800，顯著高于商品化疫苗組。

本研究采用大腸桿菌pET30a（+）表達載體原核表達完整的PCV2ORF2基因，得到富含抗原表位的重組Cap蛋白。pET30a（+）載體作為非常成熟的表達載體，其表達效率高、易于培養，擁有其他表達方式不具備的優勢。多克隆抗體作為重要的免疫診斷材料，其與單克隆抗體相比有著獨特的優勢，能識別多個抗原表位，即使少數幾個抗原表位被破壞或者抗原構象改變，實驗的結果也不會受到影響，并且制備方法較易、成本較低。兩種商品化疫苗均為滅活疫苗，海利組為PCV2 LG毒株的全病毒滅活疫苗，該毒株為PCV2中國分離株，與我國目前主要流行毒株處在同一亞型，并采用水質“海金穩”佐劑制備的滅活疫苗；普萊柯組為PCV2專利毒株SH毒株，該疫苗毒株是從臨床癥狀典型的豬群中分離出來的PCV2流行毒株，采用進口的W/O/W雙相佐劑制備的滅活疫苗，這或許是兩種免疫原制備的多克隆抗體效價出現差異的原因。

4 結論

本研究成功表達了PCV2 Cap蛋白，并成功制備了兔抗PCV2 Cap蛋白多克隆抗體，為建立PCV2抗體檢測方法和疫苗的研究奠定了基礎。