LncRNA在哺乳動物毛囊發育調控中的研究進展

常永芳 包鵬甲 褚敏 吳曉云 梁春年 閻萍，3

（1. 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2. 甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，蘭州 730050；3. 西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030）

皮膚是哺乳動物機體最大的器官，具有抵御環境侵害（寒冷、強輻射和沙塵暴）、感覺、新陳代謝和體溫調節等多種功能。毛囊作為皮膚的一種可再生微小器官，在毛纖維的產生中起重要作用，其生長發育表現出周期性［1-3］。毛囊的這種周期性循環是由眾多刺激和抑制因子及信號通路之間嚴格控制的平衡和相互作用來調節的，是一個復雜的空間互作系統［4-6］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類存在于真核生物中長度大于200 nt、無長閱讀框，但具有帽子結構和poly A尾巴的RNA分子［7-8］。在整個基因組中存在普遍的轉錄調控現象，涉及表觀遺傳調控、細胞周期調控和細胞分化調控等生命活動，已成為遺傳學研究的熱點。大量研究表明，lncRNA在皮膚毛囊發育過程中充當重要角色，參與調控毛囊及毛發纖維生長相關基因的表達；且與毛囊發育和周期性變化密切相關，可通過與眾多生長因子和信號通路相互作用來發揮其生物學功能。本文綜述了近年來lncRNA在哺乳動物毛囊形態結構、生長發育和周期性變化過程中的調控作用，以及通過與其他調控因子和信號通路之間的互作對毛囊及毛發生長的影響，為經濟動物毛品質的提高和研究哺乳動物毛囊生長相關lncRNA的作用及調控機制提供理論基礎。

1 lncRNA的發現、分布及生物學功能

lncRNA是一類最早在鼠全長cDNA的高通量測序中發現的長度超過200 nt的RNA分子，自身不編碼蛋白［10-13］。最初由于lncRNA不編碼蛋白質，被認為不具備生物學功能，視其為“轉錄噪音”［14-15］。之后的研究表明，lncRNA參與X染色體沉默、染色體修飾和基因組修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內轉運等生物過程，對其調控機制的研究越來越廣泛［16］。目前lncRNA在全基因組水平上的研究已經涉及動植物、真菌、原核生物，甚至病毒［17］?；诨蚪M中lncRNA的方向和位置，可分為不同的亞型：基因間（Intergenic）、內含子（Intronic）、反義（Antisense）、重疊（Overlapping）、雙向（Processed）和加工（Transcript）［17-22］。lncRNA 是非編碼 RNA亞型中最大的一類，據統計，包含人類近30 000種不同的轉錄本，是非編碼轉錄本的主要組成部分，超過了編碼蛋白RNA；哺乳動物蛋白編碼基因占總RNA的1%，lncRNA占總RNA的比例可達4%-9%，主要分布在細胞核內，也有部分存在于細胞質中［16-19，24］。lncRNA 不同于 miRNA，其作用機制復雜，可以通過多種不同的方式調控基因表達和蛋白質合成［19］，這與其復雜的空間結構和lncRNA所處的位置密切相關。研究發現，lncRNA可以通過特定的序列以堿基互補配對的方式與靶基因結合，從而直接或間接的調控基因的轉錄與翻譯。lncRNA復雜的空間結構是其生物學功能和生物過程調控的中心。目前發現的大部分lncRNA都具有保守的二級結構及一定的剪切形式和亞細胞定位［16，25-26］。lncRNA存在于生命的每一個分支中，機體的復雜性與非編碼RNA表達序列的多樣性和相關性遠比與蛋白編碼基因的相關性強得多［27］。其生物學功能涉及表觀遺傳、mRNA降解和轉錄翻譯調控、細胞周期調控、剪切調控、胞內物質運輸和染色體重塑以及參與細胞分化和發育模式、疾病發生、細胞結構維護等多種生物學過程［8，17，28-29］。此外，lncRNA 作為支架、誘餌、信號及引導分子從不同層面通過基因組靶向、順式或反式和反義干擾發揮作用［30-31］。在哺乳動物基因組中，lncRNA的重要性已引起了研究人員的高度關注，隨著研究深入，已鑒定的lncRNA數量快速增加，但仍有很多未知的lncRNA，尤其與毛囊發育相關lncRNA的鑒定甚少。

2 哺乳動物毛囊生長發育

2.1 毛囊發生及形態結構

毛囊在哺乳動物整個生命過程中不斷更新，通過激素、神經肽和免疫細胞之間復雜的相互作用來調節毛發的生長。這種復雜的相互作用誘導毛囊產生高度角質化組織及不同類型的毛發。根據毛囊所處位置，其大小和長度也存在一定的差異，但其結構基本相似。毛囊的形成發生于胚胎階段，主要依賴于真皮細胞和上皮細胞間發生的一系列信號傳導，真皮產生的初始信號（“第一真皮信號”）誘導胚胎表皮增厚形成基板［32］，毛母質細胞在基板下局部凝結（真皮凝結），形成“真皮凝聚物”，真皮凝聚物中產生的“第二真皮信號”和基板之間的信號交換使上皮細胞增殖分化并向下生長至真皮，最終包裹真皮凝聚物，形成毛乳頭細胞［33］，在毛乳頭細胞的刺激下上皮細胞進一步增殖和分化導致內根鞘和毛干的形成［34］。毛囊由三個同心閉合的圓柱體結構構成，最外層的為外根鞘，外根鞘可以將毛囊的整個結構與真皮層隔開；位于中間的是內根鞘，它是決定最內層毛干外形及其向體表生長的關鍵部位，毛干位于該結構的最內層，根據毛囊類型可產生初級毛發和次級毛發。毛囊可分為初級毛囊和次生毛囊（次級毛囊），初級毛囊發生早，其毛球部位較大，毛囊整體結構較粗較長，有汗腺和皮脂腺，毛干有髓質，主要生產粗毛；次級毛囊發生較晚，毛球直徑相對較小，深度淺，主要圍繞初級毛囊分布，沒有汗腺和豎毛肌等完整的附屬結構，毛干無髓質，多產生絨毛［35］。不同物種或同一物種不同部位的毛囊發育及其毛囊密度也存在一定的差異，如美利奴羊個體毛囊密度可達107-108個，而人的只有500萬個［36］。

2.2 毛囊的周期性生長

毛囊的周期性生長發育是其最為重要的特征，這種周期性的模式形成是由上皮細胞和真皮細胞之間的分子和細胞交流產生的結果［37］，變化主要集中在毛囊底部的毛乳頭形態結構的改變以及新毛干的產生和舊毛干的脫落。哺乳動物的毛囊生長周期一般經歷三個階段，即生長期、退行期和休止期。

2.2.1 生長期 生長期是毛囊生長最活躍的階段［38］，也是牛、羊等大部分哺乳動物周期經歷最長的一個階段，在此階段，毛囊凸出區域的干細胞迅速增殖，毛囊根部的毛乳頭不斷增大并開始向皮膚深處生長，此時毛母質細胞由于受到毛乳頭的調控快速增殖分化出新的毛干和內根鞘［39］。對于有色毛發來說生長期是黑色素生成階段。不同部位的毛囊產生的毛發長短不一，其長度與生長期的持續時間成正比。如人的頭皮毛囊生長期通常持續2-8年，產生長毛；而眉毛及睫毛等毛囊生長期只維持2-3個月，因此產生短毛［40］。

2.2.2 退行期 退行期是毛囊從生長期過渡到休止期的一個動態變化過程，此時隨著毛母質細胞數目減少，毛干和內根鞘分化速度減慢，毛球和外根鞘開始凋亡，毛乳頭細胞處于縮聚狀態，毛囊變小，開始從真皮乳頭脫落。

2.2.3 休止期 在休止期，細胞終止凋亡，此時的毛囊活動基本處于休眠狀態［36］。毛囊形態結構及循環周期見圖1。

圖1 毛囊組織形態結構及循環周期（改自Zhang等［58］）

毛囊的生長周期因毛囊類型（初級和次級）、部位和動物種類的不同而不同。在人毛囊發育周期中各個部位生長期存在顯著差異，例如，頭發生長期可持續2-8年，而眉毛生長期只維持2-3個月［40］。美利奴細毛羊生長期可維持2年或更久，其毛囊發育長時間處于生長期，幾乎沒有毛囊循環周期。但其馴化品種，威爾特郡羊毛囊生長周期表現出季節性，有明顯的周期性［40］。絨山羊生長期持續不及6個月［41］。此外，研究發現，絨山羊（遼寧絨山羊、河西絨山羊、內蒙古阿爾巴斯絨山羊等）、細毛羊（敖漢細毛羊、甘肅高山細毛羊等）等品種初級毛囊周期性發育不明顯，沒有明顯的界限；而次級毛囊發育呈周期性，周期通常為一年［42-46］。小鼠、兔子、豚鼠的毛囊發育經歷生長、退化，靜止階段，呈波浪式生長［47］，而人和羊毛囊循環則貫穿一生［35］。雪兔的毛囊不同于鼠、羊等物種，其結構復雜，為多級復合毛囊，初級毛囊和次級毛囊發生和生長周期不同步，其毛色變化隨季節性改變，一年可經歷兩次毛囊生長周期［48-52］。賈志海等［53］和 Mitchell等［54］研究認為短光周期和褪黑激素處理可顯著提高山羊絨的產量，而山羊粗毛不依賴光照和褪黑激素的影響。表明山羊次級毛囊生長周期依賴于季節性，同時研究發現褪黑激素可延長毛囊生長期早期，使毛囊從休止期快速進入生長初期，延長整個毛囊發育生長期［55-57］。

3 lncRNA在毛囊發育中的作用

3.1 皮膚毛囊生長發育相關lncRNA的鑒定

研究表明，真皮乳頭細胞中部分lncRNA參與了毛發相關基因調控［59］，在真皮乳頭的形成、毛囊的增殖和分化、真皮凝聚物和毛囊基板的形成中發揮重要作用，尤其是在次級毛囊的生長階段扮演重要角色［26，60-61］。郭楊等［62-63］在羊絨周期性生長特異性lncRNAs的篩選中發現，生長期和休止期有6 127個lncRNAs表達，其中54個表達存在顯著差異（上調32個，下調22個），對差異表達的lnc5479進行靶向敲除發現與毛囊的生長期密切相關，并且參與角蛋白的形成。Nie等［64］研究lncRNAs和miRNA在綿羊胎兒皮膚初級毛囊誘導中的作用時，發現差異表達的lncRNA中36個上調、26個下調，下調的lncRNA與角蛋白（KRT 14和KRT 15）、BMP信號（SOSTDC 1）、WNT信號（WNT 16和SFRP 1）和層粘連蛋白（LAMA 1）相互作用，主要影響表皮和羊毛基板的發育。Bai等［65］對絨山羊次級毛囊休止期和生長期之間轉錄模式的研究中發現了13個差異表達的lncRNAs，其中6個（lnc RNA-599618，-599556，-599554，-599547，-599531和-599509）在生長期上調，4個（lncRNA-599528，-599518，-599511和-599497）在休止期上調。Zhou等［37］運用多組學的方法對生長期、退行期兩個時期的絨山羊皮膚組織進行研究，構建了6個lncRNA文庫和6個 miRNA 文庫，鑒定出1122個已知的和403個新的 lncRNA，其中173個在生長期和退行期表達存在差異，進一步研究發現 miR-873 和lncRNA-108635596 在毛囊的周期性生長過程中具有協同作用，退行期誘導因子（TGFβ1和BDNF）在lncRNA-miRNA-mRNA網絡中受到miR-873和lnc-108635596的調控。這一發現豐富了絨山羊和其他哺乳動物中 lncRNA 的內容，更有助于理解lncRNA在毛囊生長和退化階段的分子調控機制，同時也為進一步闡明 lncRNA在絨山羊次級毛囊和羊絨纖維生長發育中的作用和調節機制奠定了基礎。Yue等［29］通過測序分析lncRNA和編碼RNA在綿羊皮膚中的作用，發現只有WNT2和FGF20在Wnt、SHH、Notch、BMP信號途徑中存在顯著差異，同時在綿羊皮膚表達譜中發現了884個新的lncRNA。進一步研究表明差異表達的lncRNA_XLOC002437和靶基因COL6A6之間可能通過正反饋調節和減少VIα6在皮膚中的沉積，來抑制皮膚纖維化并促進基板的形成和沉積。推測這些差異表達的關鍵基因和lncRNA為調控毛囊發育起始階段潛在候選基因。Zheng等［66］通過ceRNA網絡分析，從絨山羊次級毛囊中鑒定出lncRNA-000133，進一步研究分析表明，lncRNA-000133影響真皮乳頭細胞誘導特性，此外，lncRNA-000133在絨山羊次級毛囊生長期表達水平顯著高于休止期，說明lncRNA-000133可能參與次級毛囊的發生及羊絨纖維的形成和生長。

3.2 lncRNA調控動物毛囊發育

lncRNA 的作用方式多種多樣，但目前研究發現調節毛囊發育的lncRNA 大部分集中在調控相關信號通路、相關基因的甲基化水平及調控褪黑激素介導毛囊發育等方面。在人類和小鼠上研究表明，Wnt信號通路在維持毛囊誘導能力和形成新發纖維方面起關鍵作用［67-68］。同時，Wnt信號通路的抑制將會導致毛囊結構維持受損［68］。Wnt抑制因子-1（WIF-1）是Wnt的關鍵拮抗劑，也是真皮凝聚的標志物［69-70］，可負調控毛囊的生長發育。Kim等［71］研究發現，WIF-1基因啟動子區甲基化影響WIF-1 mRNA和蛋白水平的下調，認為這是激活Wnt /β-catenin途徑的重要機制。此外，HOTAIR通過在啟動子區域促進組蛋白H3K27發生甲基化，然后激活Wnt /β-catenin信號直接降低WIF-1表達［72］。Lin等［73］通過 lncRNA 微陣列研究表明Wnt途徑中一些差異表達的lncRNA可能通過表觀遺傳修飾來調節WIF-1和BMP，從而抑制毛乳頭細胞中的Wnt信號傳導，降低毛乳頭細胞誘導毛囊重建的能力。研究發現，lncRNA-000133［66］、lncRNA-H19［74］、lncRNA-HOTAIR［75］在絨山羊毛囊發育生長期的表達水平顯著高于休止期，結合啟動子甲基化分析表明，休止期lncRNA-H19、lncRNAHOTAIR、lncRNA-000133這三個基因啟動子區的高度甲基化可能參與了絨山羊次級毛囊的表達抑制。Jin等［76］使用RNA-Seq分析褪黑激素處理的遼寧絨山羊成纖維細胞中lncRNA和mRNA差異表達發現，褪黑激素可通過調節lncRNAMTC表達促進成纖維細胞增殖，當lncRNAMTC過表達時，它刺激具有相同作用的NF-κB信號通路。因此，褪黑激素通過促進lncRNAMTC表達來激活NF-κB信號通路，從而控制毛囊發育和毛發生長。同樣，Ge等［77］對體外培養的絨山羊次級毛囊干細胞進行褪黑激素處理并進行lncRNA測序，發現褪黑素的介導可引起lncRNA TCONS_00255106轉錄水平下調，lncRNA TCONS_00206163轉錄水平上調，其各自的靶基因COL4A2和THBS2是參與褪黑素調節山羊毛囊發育的潛在調節因子，說明lncRNA TCONS_00255106、lncRNA TCONS_00206163通過褪黑激素介導調控其靶基因表達，從而調節山羊毛囊發育。此外，王俊永等［78］和劉善博［79］等對細毛羊次級毛囊誘導期的差異lncRNA進行靶基因預測和鑒定發現，lncRNA也可能通過NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）、利什曼病信號通路（Leishmaniasis）、NF-kappa B信號通路（NF-kappa B signaling pathway）參與調控細毛羊毛囊形態發生及發育周期。

4 總結與展望

被毛作為牛羊等哺乳動物重要的經濟性狀，具有潛在的研究價值，而毛囊作為產生毛發的主要器官，是皮膚的重要附屬物，大多數牛羊品種一生中要經歷生長期，退行期，休止期轉變。在這種周期性活動中，不同的影響因子之間組成一個龐大而又復雜的調控網絡，它們之間通過相互抑制或協同，參與毛囊形態結構的變化及周期性生長。近年來，lncRNA作為潛在和關鍵的生物調節層受到廣泛關注，參與毛囊的產生、形態變化以及周期性循環，目前對于lncRNA在毛囊發育及毛發生長相關的研究主要集中在相關lncRNA的篩選、鑒定等方面，但對其作用機制的研究仍不明確。隨著分子技術和基因編輯技術的飛速發展，更加深入、準確的揭示毛囊周期性生長的分子機制已經志在必得，也為家畜育種工作和經濟動物毛品質的提高提供新的研究方向和思路。