藥用植物microRNA研究現狀與展望

嚴武平 吳友根 于靖 楊東梅 張軍鋒

（海南大學熱帶農林學院，海口 571100）

microRNA（miRNA）是一類小的非編碼RNA，通常為20-24個核苷酸（Nucleotide，nt），通過序列互補在轉錄后調控基因表達［1］。microRNA自身不具備開放閱讀框架（ORF），不編碼蛋白質，具有高度保守性、組織特異性和階段特異性，通過切割靶mRNA和抑制mRNA翻譯，可在動植物中發揮重要的調控作用。1993年，Victor Ambros和他的同事Rosalind Lee及Rhonda Feinbaum發現了一種控制秀麗隱桿線蟲幼蟲發育時間的基因Lin-4，該基因不編碼蛋白而是產生一對小RNAs。一個RNA的長度約為22 nt；另一個約為61 nt；較長的一個被預測會折疊成一個莖環，這個莖環被認為是較短的RNA的前體［2］。Ambros和Ruvkun實驗室隨后發現這些lin-4 rna與lin-14基因3'UTR的多個位點具有反義互補。這種互補性出現在3'UTR區域，該區域先前被提議用lin-4基因產物介導lin14的抑制［2-3］。Ruvkun 實驗室繼續證明了這些互補位點對于lin-4調控lin-14的重要性，并表明這種調控在顯著降低lin-14蛋白數量的同時，不會顯著改變lin-14 mRNA的水平。2000年，Reinhart等［4］發現let-7調控lin-41并非常保守。Let-7的發現，以及當時RNAi領域的興起，讓人們意識到這種調節性小RNA可能是一種廣泛存在的基因表達調控機制［4-5］。2001年10月，Thomas Tuschl、David P.Bartel和 Victor Ambros三人分別領導的3個研究組在Science雜志同期發文，將這種小RNA命名為microRNA（微小核糖核酸），簡稱miRNA。

剛開始miRNA的研究主要集中動物方面，直到2002年才首次在植物中出現報道［6］。植物miRNA幾乎調控所有的生物學和代謝過程，包括生長發育、細胞維持和分化、信號轉導以及對逆境脅迫的響應。在藥用植物中，目前已從一些藥用植物中鑒定出miRNA，并分析了其在藥用植物中的調控作用，這對藥用植物的研究具有重要意義。本文首先對植物miRNA的生物形成途徑、作用方式以及植物miRNA及其靶基因的鑒定和驗證方法進行了概述，其后概述了miRNA調控藥用植物生長發育與藥用植物次生代謝產物生物合成，miRNA參與藥用植物逆境脅迫等研究現狀，并對藥用植物與miRNA未來的研究方向進行展望。

1 植物miRNA的生物形成途徑

植物miRNA主要是由位于基因間隔區的內源性基因（MIR）編碼的，許多miRNA在不同植物物種中是保守的［7］。植物miRNA的生物形成途徑如下：首先在細胞核內，大多數植物MIR基因被RNA聚合酶II（Pol II）轉錄成長度為幾百個核苷酸的初級產物pri-miRNA。轉錄后，pri-miRNA的5'末端加上甲基鳥苷帽子（m7GPPPN）結構，3'末端加上多聚腺苷酸尾（或聚A尾），以穩固pri-miRNA。隨 后，pri-miRNAs經 由 DICER-LIKE1（DCL1），HYPONASTIC LEAVES1（HYL1）和SERRATE（SE）為核心組分組成的切割復合物處理，生成成熟的miRNA/miRNA*雙鏈體［8-9］。DCL1主要是以基到環方式分兩步處理pri-miRNA。首先切割的是距莖基部15-17 nt或在環形遠端莖內的隆起或非結構區域。由此產生的pre-miRNA被DCL1進一步切割生成一個長度為21 nt左右的 miRNA / miRNA *雙鏈［10-11］。miRNA / miRNA *雙鏈兩個3'末端的自由羥基被甲基轉移酶HUA ENHANCER1（HEN1）甲基化，以羥甲基的形式存在，甲基化的3'末端被保護不受降解［12-13］，穩定后的雙鏈在HASTY（Exportin 5在植物中的同源基因）的作用下從細胞核運送到細胞質［14-15］。miRNA / miRNA *雙鏈進入細胞質后，被裝載到ARGONAUTE（AGO）蛋白中，在解旋酶的作用下解離成2條單鏈，成熟的單鏈miRNA與AGO蛋白結合（以及一些其他蛋白）形成活性RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）［16］。另一條互補鏈（miRNA *）除具有的少數功能被保留外其余多數被降解。

2 植物miRNA的作用方式

植物miRNA通過轉錄切割和翻譯抑制兩大機制在轉錄后水平調控靶基因。植物miRNA需要高的互補性來識別其底物［17］。2014年的一項研究表明，在擬南芥中，除了互補，miRNA結合位點的環境和表達水平也可能有助于目標識別［18］。用大規模平行末端分析（Parallel analysis of RNA ends，PARE）對miRNA 介導的降解 mRNA 的剪切片段進行分析發現，大多數植物miRNA目標都經歷了轉錄產物的切割［19］。切割由AGO蛋白的PIWI域完成，該結構域形成RNase H樣折疊并顯示核酸內切酶活性；這種活性已經在主要miRNA效應物擬南芥 AGO1以及AGO2、AGO4、AGO7和 AGO10中得到證實［20-21］。AGO1切割不需要3'端脫腺苷化或5'端脫帽，就能通過核外酶觸發靶mRNA的降解。切割時，5'和3'的切割片段隨后被核外酶降解。在擬南芥中，核糖核酸外切酶4（Exoribonuclease，XRN4）是一種5'-3'的核酸外切酶，負責降解3'片段［22］。

miRNA介導的翻譯抑制最初是為了解釋miRNAs對靶基因抑制的不成比例的影響，即在蛋白質對mRNA水平上［23-24］。后來又對miRNA介導的翻譯抑制機制進行了深入研究。2013年的一項研究表明，在植物中，AGO1-miRNA在與目標RNA的5'非翻譯區（UTR）或開放閱讀框架結合后，能夠有效地抑制核糖體的合成或運動［25］。這表明miRNAs可以抑制植物中靶RNA的翻譯起始和延伸。有研究表明miRNA介導的翻譯抑制與加工體（P-body）之間存在一定的相關性［26］。目前，人們還未能就miRNA介導的mRNA翻譯阻遏機制達成共識。在植物中，翻譯抑制比轉錄切割更少被觀察到，這可能是由于普遍存在mirna引導的切割，同時由于缺乏高質量抗體，很難確定蛋白質水平。

除了mRNA的切割和翻譯抑制外，一些miRNA還會從其靶轉錄本中觸發階段性次級siRNA（phasiRNA）的產生，這在植物中是一種廣泛而保守的現象［16，27］。在擬南芥中有幾項研究將miRNA活性位點與多核糖體［28］、內質網膜［29］和膜結合多核糖體［29-30］聯系起來。由于AGO1是miRNA的主要效應器，AGO1的亞細胞定位是發現miRNA活性位點的重要線索。

3 植物miRNA及其靶基因的鑒定和驗證方法

在植物生長發育過程中miRNA 的表達具有組織特異性和時空特異性。因此，檢測和分析不同組織或樣品中miRNA及其靶基因的種類與表達特征，可為研究miRNA的生物學功能提供重要信息和依據。傳統的miRNA鑒定方法包括直接克隆、正向遺傳學和生物信息學預測。從生物樣品中分離和克隆小RNA是最直接的方法，目前已發現許多植物miRNA。然而，這種方法并不包括低豐度或在特定環境條件下或在特定組織中表達的miRNA。由于新一代深度測序技術和先進生物信息學的發展，從最開始的直接克隆到生物信息學的介入，保守及新的miRNA的尋找與克隆問題得到了極大的改善［31］。在很多藥用植物中（白木香、地黃、卷丹、豆蔻、薄荷、三七、紅豆杉、罌粟、人參和半夏等）都實現了深度序列測定（表1）。

植物miRNA與靶mRNA具有高度的序列互補性，通過促進靶mRNA的降解或翻譯抑制來負調控基因的表達實現調控功能，其自身不能直接調控植物的生長發育，所以闡明miRNA功能的關鍵步驟是識別miRNA靶基因。miRNA靶基因的鑒定是miRNA生物學功能研究的關鍵和難點，目前最常用的研究技術是計算機輔助預測和試驗驗證。植物miRNA作用的靶基因預測的常用生物信息學資源有BLAST［44］、psRNATarget［45］、miRdeepFinder、C-mii［46］、CleaveLand等。然而，經由生物信息學預測的靶基因存在一定的假陽性，研究人員一般還會采用一些生物學實驗來驗證miRNA是否可以靶向切割或抑制靶基因的表達［47］。驗證靶基因常用的方法主要有5'RLM-RACE［48］、降解組測序［36，38］、qRT-PCR［32］和構建煙草瞬時表達體系等。實驗驗證方法有多種多樣，很多研究人員都會選擇聯合使用其中2-3種方法進行驗證。

表1 藥用植物miRNA的鑒定情況

4 miRNA調控藥用植物生長發育

迄今為止，miRNA已經被證明可以調節植物和動物的多種生物和代謝過程。在植物中，miRNA控制著各種發育過程，包括葉片形態、花器官發生、腋生分生組織起始等［49］。隨著 miRNA 研究的不斷深入以及相關技術的不斷完善，研究者們已從多種藥用植物中鑒定出大量的保守的和新的miRNA，并研究了其在藥用植物的生長發育階段的作用。

植物 miRNA 大多是通過調控編碼參與發育調控與細胞分化的轉錄因子進而調控植物的生長發育過程。Singh等［46］研究表明薄荷科植物精油生物合成的基因調控系統可能受miR156、miR414和miR5021的調控，此外，3種miRNA候選物（miR156、miR5021和miR5015b）也被觀察到通過調控MYB、bHLH和WDR 等轉錄因子參與毛狀體發育。Wei等［40］對不同年齡段（一年、兩年和三年）的三七根中的miRNA進行差異表達分析，發現miRNA可以靶向與三七根生長發育相關的轉錄因子，同時還調控皂苷成分的合成。Ding 等［32］采用深度測序從沙棘種子中鑒定出來137個已知miRNA和264個新的miRNA，研究發現miRNA通過靶向轉錄因子ARF2和調節因子CNR、MED調控種子大小，同時miRNA通過靶向轉錄因子HLH等調控脂肪酸生物合成。He等［33］通過對卷丹進行高通量測序鑒定出來17個miRNA家族的38個保守miRNA和44個新的miRNA，經由軟件和實驗預測保守miRNA的靶基因以轉錄因子為主，新型miRNA的靶基因主要預測為蛋白編碼基因。Li等［44］對4年生人參的根、莖、葉和花的轉錄組進行了全測序，推測人參miR172以轉錄因子APETALA2（AP2）為靶點，該轉錄因子在調控開花時間和花形態方面發揮重要作用；MYB轉錄因子可能是人參中miR5021的靶基因，在發育過程和防御反應中發揮調控作用。Samad等［50］使用計算方法描述了非模型植物小型蓼中新的miRNA的鑒定和特征，推測Pmi-nov_6的靶基因是編碼F-box蛋白、組氨酸脫氫酶和WEB蛋白家族的三個mRNA，從而參與調控蛋白質降解、組氨酸的生物和葉綠體運動，進而調控植物發育。

絕大多數miRNA具有高度保守性和組織特異性，也即miRNA在各個物種間具有高度的進化保守性且在同一物種不同組織中表達有不同類型的miRNA。Axtell等［51］發現 miR168 在裸子植物、被子植物和蕨類植物中均可被檢測到，而其它 miRNA如 miR165 /166和miR170 /171等也能在多種植物中表達。Xu 等［35］采用芯片微陣列分析技術鑒定半夏中的 miRNA，分析其在半夏葉、莖、塊莖 3 個組織器官中的表達發現，葉片中miRNA319的表達水平明顯低于莖和塊莖，對葉片形態發生可能有一定的促進作用；在塊莖中，miRNA319的表達水平是莖和葉中表達水平的近10倍，而miRNA171的表達量明顯低于莖和葉，說明miRNA319和miRNA171在塊莖中也發揮著重要作用。Wang 等［52］也采用芯片微陣列分析技術從掌葉半夏中鑒定miRNA，研究結果表明所鑒定的miRNA都具有保守性，且經qRTPCR實驗顯示，所鑒定的miRNA于掌葉半夏的不同組織中的表達量各有不同，根據有關研究推測miR166 調控的靶基因可能葉發育有關，miR156調控的靶基因與花的發育相關，以及miR319、miR167和miR164等調控的靶基因均與掌葉半夏的生長發育相關。

5 miRNA調控藥用植物次生代謝產物生物合成

次生代謝產物是由次生代謝產生的一類細胞生命活動或植物生長發育正常運行的非必需的小分子有機化合物，其產生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發育時期的特異性。次生代謝產物是植物在長期演化過程中與生物和非生物因素相互作用的結果，在植物生長發育和生理學過程中起著重要作用［53］。藥用植物發揮藥用療效主要是通過其有效成分，而這些有效成分主要是植物中的次生代謝產物，包括黃酮類、生物堿、糖苷和萜類等。藥用植物中有效成分往往具有重要的生理活性，含量卻又大多較為低下，嚴重限制了藥物的臨床使用，影響藥用植物的藥用價值。miRNA的生物學功能之一是調控植物次生代謝產物的生物合成。關于藥用植物中miRNA的鑒定有很多報道，但迄今為止，只有少數研究報道了通過miRNA調控藥用植物次生代謝產物的生物合成。

生物堿是一類通常存在于植物體中（也有少數存于動物體中）的含氮有機化合物，具有抗菌、抗炎、抗癌等功效。罌粟是一種重要的藥用植物，可合成芐基異喹啉生物堿（BIAs）作為次生代謝產物。Boke等［42］研 究 發 現，pso-miR13、pso-miR2161、psomiR408等miRNA參與了BIAs的生物合成，預測pso-miR13、pso-miR2161和psomiR408分別靶向編碼7-OMT，4-OMT和網狀氧化酶樣蛋白的基因，這些蛋白都參與生物堿的合成。煙草是研究生物堿生物合成的模式植物。尼古丁是一種煙草特有生物堿，是生物制藥、生物農藥和生物化工的重要原料。Li等［54］首先研究了miRNA的潛在作用在尼古丁生物合成途徑的調控，預測miRX17、miRX27、miRX20和 miRX19分 別 靶 向 QPT1、QPT2、CYP82E4和PMT2基因，這些基因都參與尼古丁生物合成途徑。紫杉醇是一種從裸子植物紅豆杉的樹皮分離提純的天然次生代謝產物，是一種具有抗癌活性的二萜生物堿類化合物。Hao等［38］高通量測序和降解組分析鑒定紅豆杉miRNA及其靶基因發現，miR164和miR171分別通過靶向調控紫杉烷13α-羥基化酶基因和紫杉烷2α-O-苯甲酰轉移酶基因，調控紫杉醇生物合成。

萜類化合物是由甲戊二羥酸衍生、且分子骨架以異戊二烯單元為基本結構單元的化合物及其衍生物，具有祛痰、驅蟲、鎮痛等功效。青蒿被廣泛用于治療瘧疾，青蒿中相對較低的青蒿素（有過氧基團的倍半萜內酯的一種無色晶狀體）含量是其大規模生產的限制因素。為更好地了解青蒿中miRNA對青蒿素合成的影響，Pérez-Quintero等［55］研究預測miR390將靶向參與毛狀體發育的基因，毛狀體是青蒿素合成的位點，可能成為旨在增加青蒿素含量的遺傳轉化候選基因。Fan等［37］通過對蒼耳腺毛狀體和幼葉的miRNA分析，揭示了miRNA在調節萜類生物合成中的作用，推測miR7539、miR5021和miR1134可能通過靶向上游萜類通路基因參與調節萜類生物合成。

6 miRNA與藥用植物逆境脅迫

植物在不同的逆境脅迫下誘導特異 miRNA的表達，并證實了某些 miRNA在植物遭受逆境脅迫時而做出適應性調整的過程中起著重要的調控作用［56］。許多研究表明，miRNA參與多種非生物脅迫和生物 脅 迫。 例 如，miR398，OsmiR399、miR395等miRNA參與植物對營養脅迫的應答過程［57］。我國藥用植物資源豐富，但隨著研究的不斷深入，其需求也在不斷增加。野生藥用植物產量普遍較低，易受外界環境的影響。因此，研究藥用植物中參與逆境脅迫相關的miRNA也具有重要的意義。到目前為止，研究者們已經使用了不同的生物技術和鑒定方法來研究參與藥用植物逆境脅迫的miRNA，并取得了一些進展。

Nadiya等［34］通過深度測序鑒定了可能參與豆蔻野生基因型防御應答、脅迫和植物生長特性的miRNA，差異表達分析顯示，鑒定出的miRNA大部分在栽培品種中高表達，而miR169在野生豆蔻中的低表達和miR529的高表達證明了野生基因型比栽培品種具有更強的抗旱性和花發育能力。Wang等［52］對掌葉半夏中的miRNA研究發現，miR397在葉片組織中的表達水平幾乎是莖部的8倍，其作用的靶基因與氧化脅迫、干旱脅迫、冷脅迫、營養脅迫、銅脅迫等各種脅迫響應有關。Wu 等［58］對5年生人參的葉、莖、花和根進行高通量測序，鑒定出了33個miRNA家族的73個保守miRNA和9個miRNA家族的28個非保守miRNA，并對其中一些miRNA進行了預測與實驗驗證，分析發現非保守miRNA中 miR6138、miR6135e、miR6135i、miR6140a、miR6143-3p與高溫脅迫有關，而miR6136b、miR6135k、miR6139、miR6140d、miR6140則 與 高溫脅迫和干旱脅迫都有關。此后另一研究小組［44］對4年生人參的根、莖、葉和花的轉錄組進行了測序分析發現，在新確認的14條miRNA中miR1128、miR5658、miR5021 靶向鋅指蛋白，參與氧化脅迫和其他非生物脅迫應答。

7 總結與展望

中國是藥用植物資源最豐富的國家之一，對藥用植物的發現、使用和栽培有著悠久的歷史。然而隨著需求量的增加，野生藥用資源已遠遠不足以提供所需，且野生資源易受環境的影響。miRNA是一種重要的調控因子，植物miRNA幾乎調控所有的生物學和代謝過程，包括生長發育、細胞維持和分化、信號轉導以及對逆境脅迫的響應。近年來，植物miRNA的研究報告呈爆炸式增長，大批量的miRNA已從藥用植物中被鑒定出來。預測了大量miRNA靶基因，其中一些靶基因得到了實驗驗證。這些初步工作將為今后該領域的研究奠定基礎。目前大多數miRNA的功能尚不清楚，在miRNA的鑒定和功能的確認之間存在很大的差距。對miRNA介導基因調控的研究可能會為改善藥用植物的性狀提供新的策略，如提高藥用植物產量、質量或抵抗各種環境脅迫。隨著新的植物育種技術的發展，加上對整個基因組的結構和功能的更深層次的研究，將促進未來培育藥用植物新的重要性狀的技術進一步發展。

藥用植物可產生次生代謝產物，用于植物醫學。然而這些次生代謝產物在藥用植物中產出量極低，且次生代謝物質的產生是發育程度、組織分化及外界刺激因素通過影響生物合成基因表達而控制［59］。因此，研究人員尋找一種方法來增加藥用植物中次生代謝產物的含量成為當務之急。到目前為止，已有少數研究報道了通過miRNA調控藥用植物次生代謝產物生物合成［60］。對于許多藥用植物來說，獲得足夠的次生代謝物產量通常是一項困難的任務。因此，我們需要一個有效的程序來操縱藥用植物，以改變次生代謝產物水平。從這個意義上說，已經有文獻證實miRNA在藥用植物次生代謝物的產生中起關鍵作用［61］。盡管有許多關于鑒定可能的miRNA作為各種藥用植物次生代謝物生物合成途徑中涉及的調節因子的研究，我們仍需要更深入地了解它們在植物次生代謝物生產中的調節作用。