神經節苷脂氟化寡糖在大腸桿菌中的生物合成

劉新平 譚玉萌 張雪 馮雁 楊廣宇

（上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240）

神經節苷脂是由含唾液酸的寡糖和神經酰胺組成的鞘糖脂類化合物，廣泛存在于所有脊椎動物細胞中，尤其是在神經細胞中含量豐富。它們在細胞識別、細胞免疫、細胞凋亡等多種細胞生理活動中發揮重要作用［1-2］。GM1是目前研究最深入的神經節苷脂，在神經退行性疾病如外傷性中樞神經系統損傷、早期阿爾茲海默癥等疾病中體現了重要的藥物活性［3］。GM2和GM3廣泛參與細胞間信號轉導、細胞增殖、細胞黏附和細胞運動等過程。在多種腫瘤細胞中，GM2和GM3表達增強并參與腫瘤的遷移過程，成為藥物開發的靶標［4-5］。因此，發展神經節苷脂的高效制備技術，對于研究此類化合物的生理功能、作用機制及促進新藥開發均具有重要意義。

神經節苷脂結構復雜，難以利用傳統化學催化方法進行合成。目前其主要生產來源是從天然生物組織如豬腦、牛腦中進行提取，但仍存在成本高、收率低、提取過程污染嚴重等局限［6-7］。近年來，利用生物系統進行神經節苷脂的人工合成研究取得很大進展。例如Yu等［8-9］開發了以糖基轉移酶為基礎的一鍋多酶（One-pot multienzyme，OPME）催化體系，但該體系中需要近10種酶協同作用，酶的表達、提取步驟繁多且需要消耗大量昂貴的糖核苷酸等底物，難以實現大量合成。Fierfort和Antoine等［10-11］利用代謝工程手段，在大腸桿菌體內構建了一系列用于神經節苷脂寡糖模塊合成的細胞工廠，但是由于缺少寡糖鏈和神經酰胺鏈的連接方法，無法實現完整神經節苷脂的合成。本實驗在前期研究工作中，基于合成生物學理念提出了新的神經節苷脂合成體系［12］（圖1）。該體系主要分為3步：（1）以氟化乳糖為底物，利用糖基轉移酶催化合成神經節苷脂氟化寡糖；（2）利用糖苷合成酶EGCase獨特的催化活性，催化神經節苷脂氟化寡糖與鞘氨醇組裝形成糖基鞘氨醇；（3）在鞘糖脂N-?；窼CDase催化下，糖基鞘氨醇與硬脂酸縮合形成完整的神經節苷脂。

神經節苷脂氟化寡糖的高效合成是上述整個合成體系的關鍵步驟。本研究以Escherichia coliJM107為出發菌株，該菌株敲除了半乳糖苷酶基因lacZ和唾液酸醛縮酶基因nanA，避免了氟化乳糖和唾液酸底物在胞內被大量降解。在此基礎上，在大腸桿菌中引入腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）來源的CMP-NeuAc合成酶（neuA）［13］、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）來源的 α 2，3-NeuAc轉移酶（cst）［14］、β 1，4-GalNAc轉移（cgtA）［15］、β 1，3-Gal轉移酶（cgtB）［16］和 UDP-GlcNAc 異構酶（gne）［17］，從而構建以氟化乳糖和唾液酸為底物的神經節苷脂GM3、GM2和GM1氟化寡糖生物合成途徑（圖2）。

1 材料與方法

1.1 材料

圖1 完整神經節苷脂GM3、GM2和GM1合成體系

圖2 神經節苷脂GM3、GM2、GM1氟化寡糖生物合成途徑

1.1.1 菌種與質粒 敲除了nanA和lacZ兩個基因的Escherichia coliJM107作為出發菌株用于人工生物途徑的構建，該菌株由本實驗室保存。Escherichia coliDH5α用于載體的構建，購自全式金生物有限公司。質粒pUC18由本實驗室保存，質粒pBBR1MSC3，pACYC184購自湖南豐暉生物技術有限公司。

1.1.2 試劑及培養基 PrimeSTAR Max Premix DNA聚合酶購于日本Takara公司；對氨基苯甲酸、氰基硼氫化鈉、醋酸鈉等衍生試劑購自阿拉丁試劑有限公司；相關氟化寡糖由本實驗室保存；唾液酸、甲酸、甲酸銨等購自Sigma公司；乙腈等液相用品購自上海安譜實驗科技股份有限公司。LB培養基氯化鈉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建 目的基因neuA（GenBank：U60146.1），cst（GenBank：AF130466.2），gne（GenBank：905422），cgtA（GenBank：AF401528.1），cgtB（GenBank：AF130984.1）均由本實驗室保存。重組載體采用重疊延伸PCR（Prolonged Overlap Extension cloning）的方法構建而成［18］。以重組質粒pUC18-neuA-cst的構建為例說明POEPCR的具體方法。在引物設計時，基因片段與載體之間，串聯基因之間均保留25 bp左右的同源臂，分別使用特異性引物IF1-neuA/IR1-neuA擴增第一個插入片段neuA基因，引物IF2-cst/IR2-cst擴增第二個插入片段cst基因，引物VF1-pUC18/ VR1-pUC18進行反向PCR擴增來制備線性化載體。擴增獲得的基因片段和線性載體進行膠回收后，以基因片段和線性化載體互為模板和引物進行下一輪的PCR擴增。PCR 產物直接轉化Escherichia coliDH5α感受態細胞，在含氨芐抗性的平板上挑取單克隆進行培養，培養的菌液提取質粒并測序驗證，獲得重組質粒pUC18-neuA-cst。另兩個重組質粒的構建方法同上，gne和cgtA基因串聯克隆至pBBR1MSC3載體，獲得重組質粒pBBR1MCS3-gne-cgtA，cgtB基因克隆至pACYC184載體，獲得重組質粒pACYC184-cgtB。引物設計見表1。

1.2.2 工程菌株的構建 將單質粒pUC18-neuA-cst轉入Escherichia coliJM107感受態細胞中，利用氨芐抗性平板篩選得到GM3氟化寡糖合成的菌株Strain-GM3。將雙質粒pUC18-neuA-cst和pBBR1MCS3-gnecgtA電轉化至Escherichia coliJM107感受態細胞中，利用氨芐和四環素雙抗平板篩選得到GM2氟化寡糖合成的菌株Strain-GM2。將3質粒pUC18-neuA-cst、pBBR1MCS3-gne-cgtA和pACYC184-cgtB共同轉化Escherichia coliJM107菌株，利用氨芐、四環素和氯霉素三抗平板篩選獲得GM1氟化寡糖合成的菌株Strain-GM1。

1.2.3 工程菌株的發酵 挑取Strain-GM3、Strain-GM2、Strain-GM1的單克隆分別接種于相對應抗性的4 mL液體LB培養基中，于37℃恒溫搖床中震蕩培養過夜。按1%的接菌量將3種新鮮菌液接種至200 mL含相應抗性的LB液體培養基中，于37℃的恒溫搖床中震蕩培養至OD600為0.8左右。加入終濃度為50 mg/L的IPTG誘導劑、終濃度為2 g/L的氟化乳糖和終濃度為1.5 g/L的唾液酸，于30℃恒溫搖床中震蕩培養90 h，并在培養過程中取樣分析。

表1 重組載體構建引物設計

1.2.4 發酵產物的檢測及鑒定 使用HPLC柱前衍生的方法對GM3、GM2、GM1氟化寡糖進行定量檢測。利用對氨基苯甲酸衍生化試劑對3種寡糖還原端的醛基進行衍生化，衍生試劑為：10 mg/mL對氨基苯甲酸和10 mg/mL氰基硼氫化鈉溶于4%（W/V）醋酸鈉-甲醇緩沖液中。取不同發酵時間下的新鮮發酵液，超聲破碎收集上清液，加入4倍體積的衍生試劑，置于70℃的恒溫水浴中保溫45 min后終止反應，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液用于HPLC檢測。3種寡糖標準品與樣品的衍生化處理方法保持一致。HPLC檢測系統是配有熒光檢測器的安捷倫1260高效液相色譜系統，液相色譜柱為 HALO Glycan（4.6×150 mm，2.7 μm）；熒光檢測（FLD）激發波長Ex = 313 nm，發射波長Em = 358 nm；流動相A為0.05 mol /L甲酸銨水溶液，流動相C為純乙腈；洗脫條件：0-2 min 80% C，2-10 min 80% C到55% C，10-12 min 55% C，12-12.5 min 55%C到80% C，12.5-15 min 80% C；流速為0.6 mL/min；進樣量為3 mL。LC-MS檢測系統是安捷倫6500系列四極桿（Q-TOF）液質聯用系統，色譜條件同上，ESI負離子源，分子量掃描范圍100-1 100。

1.2.5 工程菌株的優化 透酶的過表達：透酶基因lacY和nanT合成后，利用相同的載體構建方法，將lacY-nanT片段插入pUC18質粒得到pUC18-neuA-cst-lacY-nanT。將新的重組載體分別替換原菌株中pUC18-neuA-cst質粒，得到透酶過表達的寡糖合成菌株。啟動子的更換：大腸桿菌啟動子文庫由武漢大學劉天罡教授饋贈，可以用于基因表達量的精確調控［19］。在大腸桿菌啟動子文庫中選取強度不同的啟動子，以pUC18質粒原Lac啟動子強度作為參照，實驗中所用啟動子由強到弱的排列順序為pXET11、pXET31、pTrc、pLac、PXETa34、pXET41。在透酶過表達菌株的基礎上，將5組啟動子片段分別替換pUC18質粒上原有啟動子片段，載體和菌株的構建方法同上。包含不同啟動子的菌株進行平行發酵，以原菌株為對照，檢測寡糖產量的變化情況。

2 結果

2.1 重組質粒及工程菌株的構建

擴增得到的neuA-cst片段的大小為1 551 bp，gne-cgtA片段的大小為2 158 bp，cgtB基因片段的大小為912 bp，neuA-cst-lacY-nanT片段大小為4 315 bp，與理論大小均一致。重組質粒pUC18-neuA-cst、pBBR1MCS3-gne-cgtA、pACYC184-cgtB和 pUC18-neuA-cst-lacY-nanT經基因測序驗證正確，重組質粒pUC18-neuA-cst-lacY-nanT的PCR驗證結果如圖3-E。Strain-GM1、Strain-GM2、Strain-GM3的構建示意圖如圖3-A，3組菌株進行菌落PCR鑒定（圖3-B-D），陽性克隆片段的大小均與理論大小一致，說明菌株構建成功。

A：Strain-GM3、Strain-GM2、Strain-GM1 菌株構建示意圖（斷裂箭頭表示敲除基因，實心箭頭表示引入基因，三角形表示啟動子）。B：Strain-GM3菌液PCR驗證 ，M：DNA Marker；1：neuA-cst片段PCR產物。C：Strain-GM2菌液PCR驗證， M：DNA Marker；1：neuA-cst片段PCR產物；2：gne-cgtA片段PCR產物。D：Strain-GM1菌液PCR驗證， M：DNA Marker；1：neuA-cst片段PCR產物；2：gne-cgtA片段PCR產物；3：cgtB 片段PCR產物。E：質粒pUC18-neuA-cst-lacY-nanT的PCR驗證，M：DNA Marker；1-2：neuA-cst-lacY-nanT片段PCR產物

2.2 寡糖定量檢測方法的建立

利用高效液相色譜建立了GM3、GM2、GM1氟化寡糖的定量檢測方法。3種產物檢出限均小于0.1 mg/L，GM3、GM2、GM1 氟化寡糖標準品的保留時間分別為11.21 min、11.82 min、12.38 min。在0.5-100 mg/L檢測范圍內，質量濃度和色譜峰面積呈現良好的線性關系。工程菌株發酵液的檢測結果如圖4，LC-MS檢測顯示產物峰的m/z為634.2009、837.2798、999.3319，確定產物峰對應的化合物為GM3、GM2、GM1氟 化 寡 糖。Strain-GM3、Strain-GM2、Strain-GM1菌株發酵液分別在11.24 min、11.83 min、12.39 min出現目標產物峰，與對應標準品的保留時間一致。

2.3 工程菌株的發酵

Strain-GM3、Strain-GM2、Strain-GM1進 行 搖瓶發酵。取樣時間為0、4、10、16、20、26、32、48、54、66、72、77和90 h。測定菌體的生長密度（OD600）并根據對應的標準曲線計算樣品的濃度，菌株的生長及產量變化曲線如圖5，3種菌株在0-26 h期間均快速增長，26 h之后均逐漸趨于穩定。GM3氟化寡糖在72 h左右產量最高達到約54.2 mg/L，GM2氟化寡糖在66 h左右產量最高達到約12.3 mg/L，GM1氟化寡糖在54 h左右產量最高達到約7.7 mg/L。

2.4 工程菌株的初步優化

外源底物氟化乳糖和唾液酸分別在乳糖透酶lacY和唾液酸透酶nanT的作用下進入細胞內，透酶過表達菌株的寡糖產量變化如圖6-A。以原菌株作對照，3種寡糖的產量均有20%左右的提升。不同啟動子強度的菌株平行發酵結果如圖6-B-D）所示。以原Lac啟動子作對照，GM3氟化寡糖合成菌株在利用pXET31啟動子時產量提高約25%（圖6-B），GM2氟化寡糖合成菌株最適合的啟動子仍為Lac，啟動子更換的菌株產量均沒有提高（圖6-C），GM1氟化寡糖合成菌株在利用pXETa34啟動子時產量增長約28%（圖6-D）。經過優化，GM3、GM2、GM1氟化寡糖的產量分別達到81.5 mg/L、18.1 mg/L和12.3 mg/L。

3 討論

本研究通過在Escherichia coliJM107中異源表達CMP-NeuAc合成酶，UDP-GlcNAc異構酶和3種糖基轉移酶cst、cgtA和cgtB，在大腸桿菌體內建立起神經節苷脂GM3、GM2和GM1氟化寡糖的生物合成途徑。通過在大腸桿菌中表達兩種底物透酶lacY和nanT來提高底物在細胞內的濃度，可以有效促進產物的生成。工程菌株啟動子的優化顯示，3種產物最適合的啟動子強度均不相同。經過初步改造，3種寡糖的產量均有所提升，但目前產量仍較低且兩種底物利用率不高，因此仍需要對人工合成途徑進行更深入的解析和完善。

圖4 工程菌株發酵液HPLC檢測及LC-MS檢測結果

圖5 Strain-GM3（A）、Strain-GM2（B）、Strain-GM1（C）菌株生長及產量曲線

圖6 工程菌株的初步優化

隨著代謝途徑的延長，GM3、GM2、GM1氟化寡糖的產量呈明顯下降趨勢，說明在代謝途徑中可能存在消耗寡糖產物的旁路途徑，或是外源表達的糖基轉移酶活性不足從而限制了下游產物的生成。使用更高效的同工酶有望進一步提高寡糖的產量，如近來Klaudia等［20］發現并表征來源于Bibersteinia trehalosiand的一種新的α 2，3-唾液酸轉移酶（BtST1），該酶在以乳糖為底物時，其催化活性是已報道同類酶中最高的，從而有利于唾液酸寡糖的合成。此外，也可以對代謝網絡中各節點的中間代謝物建立系統的代謝組學分析方法，找到代謝途徑中的限速步驟，為合成途徑的優化提供指導。如武漢大學劉天罡團隊在利用鏈霉菌進行多殺菌素的異源合成時，通過代謝組學的方法確定了多個多殺菌素鏈霉菌異源合成途徑中的限速步驟，經過優化后的產量相比于出發菌提高了約1 000倍［21］。

4 結論

本研究通過在Escherichia coliJM107中構建神經節苷脂GM3、GM2、GM1氟化寡糖的生物合成途徑。以氟化乳糖和唾液酸為底物，首次實現了3種神經節苷脂GM3、GM2、GM1氟化寡糖在大腸桿菌中的生物合成。