半乳糖流加對CHO細胞生長代謝及其表達的Fc融合蛋白糖基化的影響

肖政 范里 譚文松

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

哺乳動物細胞尤其是CHO細胞因具備完善的糖基化等翻譯后修飾系統，成為目前表達藥用蛋白最重要的宿主細胞［1］。葡萄糖作為最主要的碳源物質被廣泛運用于CHO細胞的培養過程。作為主要負責CHO細胞中轉運葡萄糖的轉運蛋白，Glut-1具有很高的跨膜轉運活性（Km=1-2 mmol/L），因此培養液中的葡萄糖會被快速轉運至胞漿內，經糖酵解途徑生成大量丙酮酸。但丙酮酸進入線粒體受到細胞的嚴格調控，因此多余的丙酮酸會經乳酸脫氫酶作用轉化為乳酸［2］。乳酸的累積對細胞的生長、代謝和產物表達都會造成不利的影響［3］。糖基化作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾，對藥用蛋白的生物學活性、溶解性以及半衰期等均發揮著重要作用［4］。唾液酸是蛋白類藥物糖基化修飾的一種重要形式。糖代謝過程中產生的UDP-半乳糖作為糖基單元參與唾液酸前體合成，隨后在細胞質中合成唾液酸并經載體轉運到高爾基體中，在唾液酸轉移酶的作用下將唾液酸連接到蛋白糖鏈末端的半乳糖上［5］。

半乳糖結構與葡萄糖類似，不過它主要通過細胞膜上的轉運蛋白Glut-4（Km=10 mmol/L）進入胞內，在半乳糖激酶和1-磷酸半乳糖尿嘧啶轉移酶的作用下生成UDP-半乳糖［6］。UDP-半乳糖可以通過異構酶的作用生成6-磷酸葡萄糖，作為碳源進入糖酵解和TCA循環供給能量。由于轉運蛋白Glut-4的轉運活性遠低于Glut-1，因此半乳糖進入細胞的速率也遠小于葡萄糖進入細胞的速率，培養液中乳酸的累積濃度也低于采用葡萄糖作為碳源的培養過程。由此可見，半乳糖是葡萄糖理想的碳源替代物，具有顯著改善細胞代謝和提高蛋白質量的可能。

本研究在補料分批培養過程中，通過將補料培養基中的葡萄糖用等摩爾的半乳糖進行替換考察以半乳糖為碳源的培養過程中CHO細胞的生長代謝和Fc融合蛋白的合成特性，了解營養物消耗和代謝副產物累積的規律，認識半乳糖濃度對細胞生長、營養物消耗、乳酸代謝、產物合成和產物糖基化的影響，旨為建立高產、高質的流加培養過程。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用細胞為表達Fc融合蛋白的CHO細胞株。傳代及基礎培養基由21.21 g/L的EX-CELL 302無血清培養基配制而成，并添加1.6 g/L的NaHCO3和2 mmol/L的Glutamine；補料培養基由我室自主研發，由多種氨基酸、維生素以及葡萄糖組成，從接種第2天起每天補加初始培養體積的3%，補料培養基中半乳糖等摩爾替代葡萄糖的實驗設計如表1所示。本文中提到的試劑如未特殊說明均購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 種子細胞培養 從細胞庫中復蘇CHO細胞，以5.0×105cells/mL的活細胞密度接種于125 mL搖瓶中（Corning），接種體積為30 mL，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中進行懸浮培養，搖床轉速為110 r/min。每隔2 d進行種子細胞傳代擴增，傳代后活細胞密度控制在5.0×105cells/mL左右。

1.2.2 搖瓶內補料培養 取指數生長期的CHO種子細胞經1 000 r/min離心5 min，棄上清，用新鮮基礎培養基進行重懸并以1.0×106cells/mL的起始密度接種于125 mL搖瓶內，初始工作體積為40 mL，搖床轉速設置為110 r/min，培養箱條件設置為5%的CO2濃度和37℃的溫度，每個條件重復3次。每天取0.8 mL細胞液用于細胞計數、生長代謝和產物表達的檢測分析。

1.2.3 反應器內補料培養 反應器內的流加培養過程于 2 L的 BIOSTAT?B（B.Braun，Germany）反應器中進行。接種密度為1×106cells/mL，初始工作體積為1 L。培養條件設置：攪拌轉速設置為80 r/min，溶氧為40%，pH設置為7.0，采用通入CO2或補加NaOH的方式進行pH控制，培養溫度設定為37℃。

1.2.4 細胞計數 取樣0.1 mL 置于48孔板內，稀釋到適宜密度后，加入等體積0.4%臺盼藍溶液進行染色，吹打均勻后，用血球計數板計數，每個樣品計數3次，結果取平均值。

1.2.5 Fc融合蛋白表達量的檢測 采用的高效液相系統為Waters 2487 HPLC System（1525 Binary HPLC Pump ；717 plus Autosampler，2487 UV Detector，Waters）， 色 譜 柱 為 PA immune detection sensor cartridge（2.1 mm×3 cm，Applied Biosystem，USA），流動相為A相：pH為7.4的PBS緩沖液，B相：pH為3的磷酸緩沖液。進樣量為20 μL，檢測波長為280 nm，A相前3 min以1 mL/min的流速平衡，第3分鐘到第12分鐘以1 mL/min的B相進行等梯度洗脫。

1.2.6 培養液中氨基酸濃度的檢測 氨基酸濃度采用高效液相色譜（1525 Binary HPLC Pump；717 plus Autosampler；2475 Multi λ Fluorescence Detector，Waters）測定。樣品采用AccQ·Fluor 試劑（Waters）按使用說明進行柱前衍生和檢測。

1.2.7 培養液中葡萄糖、氨和乳酸濃度的測定 葡萄糖、乳酸和氨濃度采用全自動生化分析儀BioProfile 400 Analyzer（Nova Bio-medical，USA）測定。

1.2.8 培養液中半乳糖濃度的檢測 采用EnzyChromTMGalactose Assay Kit（BioAssay System），分別按相應使用說明進行測定。

1.2.9 Fc融合蛋白的純化 Fc融合蛋白采用親和層析的方法進行純化，層析柱為HiTrap Protein A HP（GE Healthcare），具體方法步驟見產品說明書。

1.2.10 總唾液酸含量的檢測 總唾液酸含量依據《中國藥典》（第三部）中間苯二酚的方法進行檢測。

1.2.11 N -連接糖基化分布的檢測 N-連接的糖基化分布采用Kim等［7］檢測方法。

1.2.12 數據分析 Fc融合蛋白的比生成速率qFcfusionprotein（mg/109cells/day）通過以下公式進行計算：

其中P為Fc融合蛋白濃度（mg/L）；IVCC為活細胞密度對時間的積分（109cells·day/L）。

2 結果

2.1 半乳糖替代葡萄糖補料培養對細胞生長代謝和產物表達的影響

2.1.1 對CHO細胞生長的影響 以1×106cells/mL的密度接種后細胞立即進入指數生長期，6個培養過程在前期體現出相似的生長趨勢，平均比生長速率約為0.73 day-1，96 h后細胞生長明顯減慢（圖1）。96 h后，GF5細胞出現快速死亡，168 h后其活細胞密度跌至3.88×106cells/mL，活性降為28.8%。同樣，GF4過程（80%替代比例）在192 h也出現了快速死亡的現象，240 h時其活細胞密度僅為2.16×106cells/mL，活性僅為26.3%，而其他培養過程細胞均維持較好的活性，同時培養終點時的活細胞密度也維持在9×106cells/mL左右。

圖1 補料培養基中半乳糖替代對細胞生長的影響

2.1.2 對CHO細胞代謝的影響 代謝方面，GF5過程葡萄糖在接種后48 h即消耗至零。隨著半乳糖替代比例的降低，葡萄糖耗竭的時間依次推后，GF4在96 h時葡萄糖濃度跌至0 mmol/L，GF3在120 h時葡萄糖濃度跌至0 mmol/L。而0%-60%半乳糖替代范圍內由于補料培養基中的葡萄糖被替代程度更低，足以滿足細胞對葡萄糖的需求，因此GF2的葡萄糖濃度在整個培養過程中都維持在10-15 mmol/L之間，Con和GF1的葡萄糖濃度則是隨著培養時間的延長而不斷升高，出現逐漸累積的現象（圖2-A）。

與葡萄糖代謝對應的，48 h葡萄糖濃度跌至0 mmol/L后，GF5的乳酸生成速率比開始明顯降低，72 h后乳酸由生成轉化為消耗狀態，最終到144 h其濃度跌至16.4 mmol/L。GF4也是當96 h葡萄糖耗竭時，乳酸被重新利用，最終減少至20 mmol/L左右。雖然GF3后期的葡萄糖濃度也跌至0 mmol/L，但并沒有引起的乳酸的再利用。其他幾組由于未出現葡萄糖耗竭的情況，乳酸濃度都隨著培養過程的進行而不斷升高，最終達到了45 mmol/L左右，3組之間的乳酸代謝沒有顯著性差異（圖2-B）。以上結果說明，在葡萄糖充足的情況下，CHO細胞以利用葡萄糖為主，當葡萄糖耗竭后，乳酸會被細胞重新利用［8］。

半乳糖的替代流加也引起了CHO細胞氨代謝的變化。GF5的氨濃度從96 h開始快速累積，最終達到了12 mmol/L左右，GF4過程中氨的濃度從120 h開始同樣有明顯升高，終濃度也達到了10 mmol/L以上。與乳酸代謝類似，Con、GF1、GF2和GF3最終的氨濃度也都隨著培養過程的進行而緩慢升高，最終達到了6 mmol/L左右（圖2-C）。

通過生化分析儀對各個培養過程的pH進行離線檢測（圖2-D），從對應過程的pH變化趨勢來看，GF4和GF5過程中pH值的升高很有可能與氨濃度的升高密切相關［9］。GF5的pH值從48 h開始快速上升，到120 h達到最高為7.8。同樣，GF4的pH值在96 h后開始快速升高，后期維持在7.6左右。而其他各組在整個培養過程中的pH均維持在6.7-7.0之間，在CHO細胞的正常耐受范圍內。

因為GF5的細胞較早地出現了死亡，因此只考察了其他過程的氨基酸代謝情況。圖3所示為244 h時培養液中各氨基酸的濃度情況。由圖可知，244 h時各過程下氨基酸的濃度基本一致，只有Glu、Gln和Ala三者顯示出了較大的區別。隨著半乳糖替代比例的增加，Glu的濃度不斷升高，其中GF5過程達到了2 146 μmol/L，是Con過程的1.7倍。同時，隨著半乳糖濃度的升高，胞外Gln的濃度逐步減少，其中GF5的最終濃度僅為112 μmol/L，幾乎消耗殆盡。結合各個過程中Gln和Glu的濃度趨勢以及氨代謝，說明在半乳糖替代比例較高的情況下，可能是葡萄糖代謝提供的能量有限，細胞轉向消耗Gln以提高能量供應，因此其胞外的Gln濃度會隨著半乳糖替代比例的增加而逐步降低，而Gln的代謝產物Glu和氨會逐漸增加。此外，Ala濃度隨著半乳糖替代比例的增加而升高，這可能與乳酸代謝有關。

圖2 補料培養基中半乳糖替代對細胞代謝和pH的影響

2.1.3 半乳糖替代補料培養對Fc融合蛋白表達的影響 蛋白表達方面，在較低半乳糖替代范圍內（0%-

圖3 補料培養基中半乳糖替代對氨基酸代謝的影響

40%），隨著半乳糖替代程度的增加蛋白表達量逐步增加，其中GF2最終達到了853 mg/L，是Con的1.21倍（圖4-A）。隨著替代比例的進一步增加，Fc融合蛋白的表達量反而逐漸下降，其中GF4僅為633 mg/L，是Con的85%，這可能是由于后期細胞的代謝出現更大的轉變，細胞維持能力變差引起的。

唾液酸是Fc融合蛋白最重要的質量屬性之一，半乳糖的流加對其影響趨勢與其對蛋白表達量的影響十分一致（圖4-B）。同樣是在較低半乳糖替代比例（0-40%）內，Fc融合蛋白的唾液酸含量隨著半乳糖濃度的升高而升高，其中GF2達到了57.02 μg/mg，比對照組提高了30%左右。但進一步增加半乳糖的替代比例，并沒有增加Fc融合蛋白的唾液酸含量，其中GF4過程反而比對照組減少了16%（圖4-B）。結合對應過程的氨代謝及pH，很有可能是在更高半乳糖的替代情況下，氨的過量生成抑制了胞內GDP-GNAc的合成，造成了Fc融合蛋白唾液酸合成前體的缺乏。

2.2 全部半乳糖替代對培養過程的影響

圖4 補料培養基中半乳糖替代對Fc融合蛋白表達的影響

為排除pH對培養過程的影響，在反應器內將pH控制在7.0左右，進一步考察了全部半乳糖替代對細胞生長和產物唾液酸的影響。結果顯示，全部半乳糖替代的情況下，并未對細胞的生長造成不利影響，其最大活細胞密度甚至達到了1.41×107cells/mL（圖5-A），比搖瓶中的Con提高了40%，雖然其活細胞密度從192 h后開始明顯下降，最終僅為8.7×106cells/mL，但其細胞活性仍維持在99%左右。葡萄糖相對搖瓶內更晚出現耗竭，第96小時葡萄糖濃度才跌至0 mmol/L（圖5-B）。從半乳糖的代謝趨勢來看，在0-192 h期間，細胞持續消耗半乳糖，其比消耗速率達到了0.54 mmol/（109cells·day），但是在192 h后，可能由于細胞狀態的改變，其并未進一步消耗半乳糖。乳酸代謝可以分為3個階段，0-120 h內乳酸持續生成，最高達到了27.5 mmol/L，其比成速率為1.96 mmol/（109cells·day）。隨后轉為消耗階段，比消耗速率為1.23 mmol/（109cells·day），當培養到192 h時，乳酸濃度也跌至0 mmol/L。氨濃度相對于搖瓶過程有明顯減少，最終濃度為9.36 mmol/L。雖然全部半乳糖替代對細胞生長代謝沒有不利影響，但其產物的比生成速率僅為10.3 pg/（cell·day），比搖瓶中的對照組減少了50%（圖5-C）。同時，雖然將整個培養過程的pH控制在適合產物表達和唾液所修飾的范圍內，但是和搖瓶的Con相比，最終產物的唾液酸含量仍然有所下降，僅為40.8 μg/mg（圖5-D）。以上結果說明，雖然在半乳糖全部替代的情況下，將pH控制在細胞的生理范圍內，有效地降低了乳酸的生成，充分地支持了細胞的生長，但對于產物的表達和糖基化修飾會造成不利影響，可能是由于胞內能量供應不足引起的。

2.3 40%比例半乳糖替代對培養過程的影響

圖5 反應器內全部半乳糖替代對細胞生長和產物糖基化的影響

為了平衡細胞的代謝和糖基化的合成，進一步在反應器內考察了40%比例半乳糖替代對培養過程的影響。將補料中40%比例的葡萄糖用半乳糖替代后，雖然最高活細胞密度較搖瓶內更低一些，只有7.9×106cells/mL，但后期卻一直維持在6×106cells/mL以上，活性也在98%左右（圖6-A）。最終Fc融合蛋白的表達量達到了1 106 mg/L，比搖瓶的Con提高了43%。此外，培養過程中Fc融合蛋白的總唾液酸含量在168 h前呈上升趨勢，最高達到了71.2 μg/mg，隨后總唾液酸含量隨培養時間的延長而下降，最終維持在60 μg/mg左右（圖6-B），但仍比搖瓶的Con提高了37%。對N-連接的糖基化分布檢測結果顯示，使用40%的半乳糖替代葡萄糖后，G0F（不帶半乳糖和唾液酸的糖型結構）的含量從15.6%減少到了10.8%，而唾液酸含量則從35.6%提高到了42.2%，減少的G0F糖型都轉化為帶唾液酸化修飾的糖基結構（圖6-C）。說明在Fc融合蛋白的表達過程中，半乳糖化修飾可能是限制蛋白唾液酸修飾的重要因素，因此半乳糖的加入可以有效地增加胞內糖基前體的合成，提高了最終唾液酸的含量。

3 討論

作為CHO細胞重要的能源物質，糖代謝在細胞的生長、代謝、蛋白的表達以及質量等方面都發揮著重要的作用。本研究以一株表達Fc融合蛋白的CHO細胞為對象，綜合考察了半乳糖替代流加對細胞生長、蛋白表達以及糖基化的影響。

細胞生長方面，在pH沒有控制的搖瓶中，60%比例以上的半乳糖替代條件下，細胞后期的活率出現了顯著的下降，這可能與過高的氨濃度直接有關［10］，也可能是由于過高的氨濃度引起了搖瓶內pH的上升，進而引起細胞的死亡［11］。在后續的反應器實驗中，通過對pH的穩定控制，氨濃度得到了有效控制，細胞活率也得到有效維持，可見使用半乳糖替代葡萄糖的流加培養并不會對細胞生長造成不利影響。

圖6 反應器內40%替代半乳糖對細胞生長和產物糖基化的影響

代謝方面，60%以上半乳糖替代比例情況下，會出現葡萄糖耗竭的現象，細胞進而轉向利用半乳糖和乳酸，因此GF4和GF5過程中的代謝副產物乳酸濃度有明顯的下降。60%替代比例的GF3過程雖然葡萄糖也控制在0 mmol/L左右，但是乳酸并沒有降低，和0-60%替代比例內維持一致，說明葡萄糖和半乳糖的代謝相互關聯。糖酵解階段，氧化還原力平衡引起的ATP能力維持對于乳酸的代謝十分重要［12］，本研究中在60%以上半乳糖替代比例下，當半乳糖提供的ATP的速率未能彌補葡萄糖濃度降低帶來的ATP損失時，乳酸開始明顯減少［13-14］。此外，結合TCA循環相關的氨基酸代謝，隨著半乳糖替代比例的增加，Glu的濃度不斷升高，胞外Gln的濃度則逐步減少。說明在半乳糖替代比例增大的情況下，可能是葡萄糖提供的能量代謝有限，細胞轉向消耗Gln以提高能量供應，因此其胞外的Gln濃度會隨著半乳糖替代比例的增加而逐步降低，而其代謝產物Glu和氨會逐漸增加。

蛋白表達和糖基化方面，0-40%以內半乳糖替代比例情況下，蛋白的表達量和總唾液酸含量都會隨著替代比例的增加而升高，而較高半乳糖替代范圍內（60%-100%），兩者反而隨著替代比例的增加而有所減少。蛋白表達也與代謝緊密相連，較高替代范圍內，基于TCA能量供應有所減少，會進一步降低線粒體的ATP勢能，從而造成產量的降低［15］。唾液酸方面，雖然更多半乳糖的加入可以增加唾液酸前體的合成，但是同時細胞有可能并不能對其進行有效吸收。在全部添加半乳糖的情況下，半乳糖出現了大量的累積，在能量供給不充分的情況下，全部替代半乳糖的情況反而降低了唾液酸的含量，同時由于代謝的遷移，過多的氨的生成也會抑制糖基化的合成［10-11］。Gramer等［16］的研究結果表明適量的半乳糖添加可以有效增加抗體半乳糖化，Liu等［17］通過寡糖分析表明半乳糖化是融合蛋白唾液酸合成的限制步驟，20 mmol/L半乳糖使Fc融合蛋白的半乳糖化糖型和唾液酸化糖型比分別提高23.5%和20.3%，Lee等［18］添加 40 mmol/L半乳糖則使凝血因子Ⅱ的唾液酸含量提高了26%。因此在本研究中40%比例替代情況下，當唾液酸前體的合成和能量供應達到有效平衡，部分G0F糖型轉化為半乳糖型，進而轉化為帶唾液酸化修飾的糖基結構，最終總唾液酸含量得到了有效提高。

4 結論

本研究以表達Fc融合蛋白的CHO細胞為對象，通過補料培養基中用半乳糖替代葡萄糖的方式有效地提高了最終的蛋白表達量和總唾液酸含量，但機制仍值得進一步研究，以利于建立高產高質的培養過程。