抗氧化基因過表達提高運動發酵單胞菌糠醛耐受性

聞遠 夏娟 戚良華 劉小偉 劉晨光 白鳳武

（1. 微生物代謝國家重點實驗室 上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240，2. 上海保興生物設備工程有限公司，上海 201404）

化石燃料使用帶來的環境污染和能源危機等問題亟待解決，開發可再生的清潔能源正逐漸引起廣泛關注。在眾多的可再生能源中，生物乙醇已經成功實現了商業化。目前生物乙醇大多由玉米、甘蔗等淀粉類或糖類作物為底物［1］，被稱為“第一代生物乙醇”。其在美國、巴西等農業發達國家有著較好的應用，但在其他國家的發展具有很大的局限性，尤其是“與人爭糧、與糧爭地”的問題難以得到有效的解決。因此，以農林廢棄物為代表的木質纖維素為底物的“第二代生物乙醇”應運而生［2-3］。木質纖維素由纖維素、半纖維素和木質素構成，其結構復雜，因此必須經過預處理和酶解才能釋放可用于微生物發酵的糖［4］。在預處理過程中還會產生大量副產物抑制微生物的生長和乙醇的生成［5］。在稀酸預處理中，木糖會轉化為糠醛，糠醛不僅消耗胞內大量還原力，還會誘發活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）的產生，破壞細胞中的DNA、蛋白質、脂質成分，損傷細胞骨架，進而引發細胞程序性死亡［6］。

工業乙醇發酵主要使用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），但在過去的幾十年中，運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis）逐漸成為研究熱點。由于其特殊的ED（Entner-Doudoroff）途徑［7］，和釀酒酵母相比，其具有較低的產能效率，在發酵過程中會產生更少的生物質并且實現更高的葡萄糖-乙醇轉化效率。但是運動發酵單胞菌對糠醛毒性十分敏感［8］，因此提高運動發酵單胞菌對糠醛的耐受性將有利于該菌的工業化應用。

為了發掘細胞抵抗抑制物毒性的基因位點，通用的研究策略是：首先通過突變、實驗室進化等方法獲得具有高耐受性表型的菌株，再采用全基因組測序、RT-qPCR等方法發掘突變或者轉錄水平發生變化的基因，最后驗證目標基因功能［9-10］。除此之外，在高濃度醛類環境下細胞中特定氧化還原酶的表達量上調，其中一些依賴于NADH、NADPH兩種輔因子的酶類［10］，能將醛類轉化為低毒性的醇類物質，或者消除醛類引發的ROS。NADH氧化酶與細菌的抗氧化能力密切相關［11-13］，如大部分乳酸菌Lactococcus lactis有氧生長過程中都會表現出該酶的活性，該酶能夠催化氧氣變成水分子，減輕氧氣誘發的ROS［13］。在光滑球擬酵母Torulopsis glabrata中異源表達L. lactis的 NADH氧化酶，可有效降低NaCl誘導的ROS，提高其高滲透壓耐受性［14］。在釀酒酵母中異源表達L. lactis的NADH氧化酶也降低了其有氧發酵條件下的ROS水平，提高菌株發酵性能［15］。NADP+還原酶催化NADPH的再生，而NADPH作為一種重要的輔因子，為抗氧化系統中還原型谷胱甘肽和硫氧還蛋白的再生提供還原力［16］。谷胱甘肽還原酶是抗氧化系統中的重要成員，依賴NADPH催化氧化型谷胱甘肽向還原型谷胱甘肽轉化［17-18］，本研究著重研究在運動發酵單胞菌中，過表達其內源NADH氧化酶基因ZMO1885、NADP+還原酶基因ZMO1753及谷胱甘肽還原酶基因ZMO12111，探究這些具有抗氧化功能的重組菌株在糠醛脅迫條件下的生長發酵性能。

1 材料與方法

1.1 材料

靶基因的選擇 通過在KEGG數據庫（https：//www.kegg.jp/）中篩選，找到運動發酵單胞菌的NADH氧化酶基因ZMO1885、NADP+還原酶基因ZMO1753和谷胱甘肽還原酶基因ZMO1211，并且對其進行過表達操作。

菌株、質粒及引物 本實驗所使用的菌株、質粒和引物見表1和表2。出發菌株為野生型運動發酵單胞菌Z. mobilisZM4。用以表達載體構建的菌株為大腸桿菌DH5α，用以載體去甲基化的菌株為大腸桿菌JM110。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 運動發酵單胞菌使用RM培養基，大腸桿菌使用LB培養基。LB培養基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化鈉，固體培養基中加入瓊脂粉20 g/L。RM培養基：20 g/L葡萄糖、2 g/L磷酸二氫鉀、10 g/L酵母提取物，固體培養基加入瓊脂粉20 g/L。模擬木質纖維素水解液：60 g/L葡萄糖、20 g/L木糖，2 g/L磷酸二氫鉀，10 g/L酵母提取物，發酵前加入0.53 g/L糠醛、0.36 g/L 5-HMF、0.34 g/L 甲酸、4.33 g/L 乙酸［19］。

培養含有目標表達載體的菌體，在培養基中添加鹽酸四環素（Tc）20 mg/L。E.coliDH5α和JM110于1.5 mL離心管、37℃、200 r/min振蕩培養，培養體積為1 mL。Z. mobilisZM4使用250 mL搖瓶于30℃培養，培養體積為150 mL，在種子培養時靜置，發酵時150 r/min振蕩培養。

表1 本實驗使用的菌株和質粒

表2 本實驗構建菌株所使用的引物

1.2.2 菌株構建與活化 以ZM4基因組為模板獲得Pgap、ZMO1885、ZMO1753、ZMO1211片段。用限制性內切酶EcoR I和PstI切割pHW20a質粒，后經凝膠電泳切膠純化后，利用同源重組的方法將目的基因和啟動子Pgap連接在線性化載體pHW20a上，熱激法轉化大腸桿菌DH5α。為克服運動發酵單胞菌限制修飾系統對轉化效率的影響，將大腸桿菌DH5α中提取的表達載體轉入JM110菌株中去甲基化。每80 μL感受態細胞加入1 μg去甲基化的質粒，靜置10 min后，轉入預冷的1 mm電轉杯中，電擊轉化。轉化子通過PCR以及電泳驗證無誤后保存于-80℃備用。

重組運動發酵單胞菌活化：取-80℃保存的重組運動發酵單胞菌在含有20 mg/L Tc的RM固體培養基上三區法劃線活化，置于30℃培養箱中靜置培養2-3 d，待菌落長出后，挑菌至含有20 mg/L Tc的RM液體培養基中，30℃培養箱中靜置培養20 h，再轉接經二次活化，用于后續發酵實驗。

1.2.3 重組菌株生長及耐受性能的測定 于-80℃保存菌株中隨機挑取3個轉化子用于生長性能評定。重組運動發酵單胞菌經活化后，將OD600調為1.5以1%轉接入150 mL含有20 mg/L Tc的RM液體培養基中，于30℃培養箱中靜置培養約15 h，將其OD600調為1.5 后10%接種于發酵培養基中，每4 h取樣測量OD600，繪制生長曲線。對于耐受性能的評估，在發酵前加入糠醛2 g/L。

1.2.4 RT-qPCR驗證 發酵6 h后取9 mL發酵液，10 000 r/min 離心2 min收集細胞，用ddH2O洗滌2次，液氮速凍用于RNA提取。使用總RNA 抽提純化試劑盒（Total RNA Extraction and Purification Kit，Sangon Biotech）提取總RNA，并利用反轉錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit，TaKaRa）將總RNA反轉成cDNA作為模板，再利用定量試劑盒（iQTM SYBR? Green，Bio-Rad）進行表達量檢測，以2-ΔΔCt方法比較重組菌株和對照菌株目標基因的轉錄量，以ZMOr009為內參基因。本實驗中使用的實時定量引物見表3。

表3 本文使用的實時定量引物

1.2.5 NADH氧化酶酶活測定 使用NADH氧化酶測試盒（蘇州科銘生物技術有限公司）測定細胞內NADH氧化酶酶活。發酵6 h后取9 mL發酵液，離心收集細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，根據試劑盒方法進行酶活的測定。

1.2.6 胞內活性氧檢測 使用探針2'，7' -二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCFDA）測定2 g/L糠醛條件下重組菌株和對照菌株細胞內ROS水平。發酵6 h后取9 mL發酵液，將OD600調為0.25，取4.5 mL發酵液，離心收集菌體，用PBS洗2遍菌體。后用500 μL的PBS重懸菌體，加入40 μL H2DCFDA，在黑暗條件下于30℃，200 r/min反應1 h。離心收集細胞，再用PBS洗去多余的熒光染料，后用500 μL的PBS重懸細胞，吸取200 μL于96孔板（黑色背景）中，使用全波長掃描儀（ENSPIRE 2300，PE），在485 nm下的激發光和535 nm下的發射光下測定其熒光強度，ROS的量以熒光強度表示。

1.2.7 NAD+及NADH 測定 使用NAD+/NADH（NAD+/NADH Assay Kit，碧云天公司）測定細胞內NADH及NAD+水平。發酵6 h后取9 mL發酵液，離心收集細胞，用PBS洗滌2次。測量NAD+的樣品重懸于1 mL 0.2 mol/L HCl 中，測量NADH的樣品重懸于0.2 mol/L NaOH中。超聲破碎細胞后將懸浮液煮沸5 min，在冰浴中快速淬火，然后在離心管中先后加入500 μL的樣品和500 μL 0.2 mol/L NaOH（測量NAD+）或0.2 mol/L HCl（測量NADH）。將混合物10 000 r/min離心10 min后，收集上清液，根據NADH檢測試劑盒的方案，用上清液測定NAD+和NADH的含量。

1.2.8 模擬木質纖維素水解液發酵性能檢測 將種子培養至OD600約2.5，20%接種于模擬木質纖維素水解液中。每12 h取一次樣測量OD600，繪制生長曲線。發酵液中葡萄糖、乙醇、糠醛、5-HMF含量分析采用 Waters e2695 高效液相色譜（Waters，MA，USA）系統，裝配 Aminex HPX-87H 有機酸分析柱（300 mm×7.8 mm，Hercules，Bio-Rad）和示差檢測器（Waters 2414）。進樣量 20 μL，流動相為 0.004 mol/L的硫酸溶液，流速 0.6 mL/min，示差檢測器溫度 50℃，柱溫 65℃。

2 結果

2.1 重組菌株生長性能評價

利用質粒pHW20a分別過表達基因ZMO1885、ZMO1753、ZMO1211，探究過表達基因對于運動發酵單胞菌生長性能的影響。如圖1-A所示，過表達ZMO1885和ZMO1211對菌株的生長沒有顯著影響，但是過表達ZMO1753卻對菌株的生長產生了明顯的負面影響。菌株到達穩定期的時間延長，最大OD600降低，僅能達到對照菌株的90.03%。在耗糖能力和乙醇生產能力上，和對照菌株相比，ZMO1885（圖1-B）和ZMO1211（圖1-D）過表達菌株沒有明顯差異。但是，過表達ZMO1753基因的工程菌株受生長減慢的拖累，耗糖速度和乙醇的產率都明顯降低（圖1-C）。運動發酵單胞菌的單基因操作可對其生長性能產生負面影響，降低的生物量進而影響到糖耗速率和乙醇生產力。因此，在獲得重組菌株后有必要對其生長性能、糖耗、乙醇生產力進行評估。

2.2 重組菌株耐受性能評價

為考察糠醛抑制對照菌株ZM4/20a生長的效果，將ZM4/20a置于含有0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的糠醛培養基中進行培養，測得細胞的生長曲線以及達到穩定期的OD600。

如圖2-A所示，高濃度的糠醛抑制了細胞的生長，不僅降低了細胞在對數生長期的生長速度，還延遲了細胞到達穩定期的時間。由于菌株在24 h可以達到最大OD600。對菌株最大OD600和與之對應的糠醛濃度進行擬合（圖2-B），計算得糠醛的IC50為0.865 g/L，IC75約為2 g/L。為了篩選出耐受性較強的菌株，選擇IC75（～2 g/L）的糠醛濃度檢測3個重組菌株的生長。選擇24 h進行生物量的比較，初步評估其耐受性能（表4）。

圖1 重組菌株生長性能評價

圖2 糠醛耐受曲線

表4 重組菌株耐受性評估

如表4，在無糠醛的條件下ZM4/ZMO1885與ZM4/20a的 OD600沒有顯著差異，但是在2 g/L糠醛的抑制下，ZM4/ZMO1885凸顯出生長優勢，其OD600是對照組的138.48%，表明過表達ZMO1885能夠提高菌株對于糠醛的耐受性。

過表達ZMO1753基因會使得菌株在正常培養條件下生長差于對照菌株，僅能達到對照最大OD600的90.03%，但是在含有2 g/L的糠醛條件下生長時，其最大OD600略高于對照菌株ZM4/20a，能達到其最大OD600的109.07%。盡管ZMO1753基因過表達干擾了菌株的正常生長，但在糠醛抑制條件下ZMO1753編碼的酶提高了糠醛耐受性，從而抵消了其對于菌株生長的負面影響。

過表達ZMO1211沒有影響菌株在無糠醛培養基中的生長，但是在2 g/L糠醛存在的條件下，卻降低了菌株對于糠醛的耐受性，最大OD600僅能達到對照菌株的74.1%。

對于代謝網絡簡單、產能效率低下的運動發酵單胞菌而言，需要考慮改造基因是否會對菌株生長造成負面影響，同時在判斷基因對于脅迫耐受作用時，也必須扣除掉該基因操作對生長性能的影響。

2.3 胞內活性氧自由基檢測

在運動發酵單胞菌中過表達ZMO1885編碼的NADH氧化酶可以提高菌株對糠醛的耐受性，過表達ZMO1753也對糠醛耐受性提高有一定的效果。進一步檢測 ZM4/20a、ZM4/ZMO1885、ZM4/ZMO1753菌株胞內的ROS水平，探索耐受性提高與基因抗氧化功能之間的相關性。

圖3 重組菌株及對照菌株ROS水平測定

如圖3所示，ZMO1885編碼的NADH氧化酶過表達能顯著降低胞內的ROS水平。和對照菌株ZM4/20a相比，菌株ZM4/ZMO1885的ROS水平降低了52.10%，減輕糠醛所引發的ROS對細胞的傷害，改善了菌株在糠醛條件下的生長狀態。ZMO1753過表達菌株中ROS水平也顯著下降，說明該基因也能降低糠醛引發的ROS。但該基因過表達給菌體生長帶來的負面作用，抵消了部分耐受糠醛的優勢，生長性能上僅略優于對照菌株。

2.4 ZMO1885過表達菌株基因表達效果分析

通過生物量和ROS實驗，證明了所挑選3個基因中僅ZMO1885過表達能夠顯著去除胞內ROS，并顯著提高菌株在糠醛抑制下的生物量。為考察該基因過表達對細胞的其他影響，表5展示重組菌株與對照菌株的ZMO1885基因表達量、NADH氧化酶酶活及NADH/NAD+比值。盡管構建菌株中使用了強啟動子Pgap，重組菌中的ZMO1885表達量僅僅比對照菌株上調了2.26倍，該基因的表達量可能受到細胞嚴格控制。NADH氧化酶酶活實驗與轉錄數據相符合，實驗測得的所有以NADH為輔因子的全細胞NADH氧化酶酶活僅微弱上升8.28%。一方面重組菌中的酶量和酶活改變小，另一方面，細胞內除ZMO1885編碼的NADH氧化酶外，還存在其他能利用NADH作為輔因子的氧化還原酶，因此導致胞內的NADH/NAD+比例并沒有顯著的差異。綜上所述，過表達ZMO1885并未引起運動發酵單胞菌氧化還原水平失衡的現象，不會影響其他利用NADH作為輔因子的氧化還原酶的功能。因此在無抑制物添加情況下并沒有造成對菌體生長的影響。而當有糠醛加入后，又能發揮自身的功能去除ROS，避免細胞死亡。

表5 ZMO1885過表達效果檢測

2.5 NADH氧化酶過表達菌株在模擬木質纖維素水解液中發酵效果

在木質纖維素預處理水解液中，除了糠醛之外，還存在多種其他種類的重要抑制物：甲酸、乙酸、5-HMF等。因此，基于之前實驗結果，挑取表型最優的菌株ZM4/ZMO1885采用模擬木質纖維素水解液進一步驗證其發酵性能及耐受性能。

表6為對照菌株和重組菌株在對數生長中期發酵性能上的差異。在模擬木質纖維素水解液中，ZM4/ZMO1885的生長顯著優于對照菌株ZM4/20a，相應的發酵性能也有所提高。在發酵時長達到對數中期36 h，ZM4/ZMO1885的殘糖量僅為ZM4/20a的20.56%，而乙醇濃度為其2.95倍。在前36 h內，菌株ZM4/ZMO1885的生物量提高了46.91%，糖耗速率提高了110.29%，乙醇生產力提高了195.24%。不僅如此，重組菌株針對水解液中的糠醛及5-HMF的去除率更高，分別為98.10%和64.55%，而對應的對照菌株僅為89.39%和30.79%（圖4）。

3 討論

本實驗所研究的基因ZMO1885、ZMO1753、ZMO1211均為運動發酵單胞菌內源基因。其編碼的酶均具有抗氧化能力，減輕由糠醛誘發的ROS對細胞的損害（圖5）。

對運動發酵單胞菌進行基因工程操作時，要嚴格考慮選取的基因并對重組菌株進行生長性能檢測。ZMO1885和ZMO1211的過表達未對菌株的生長、糖耗、乙醇生產產生明顯的影響。過表達ZMO1753會引起其生長的滯后以及最大OD600的降低，造成糖耗速度和乙醇生產力變低。由基因操作引起的生長性能改變歸因于兩方面：（1）運動發酵單胞菌代謝網絡簡單和生產能量效率低。運動發酵單胞菌沒有完整三羧酸循環，每消耗1 mol葡萄糖，只能經由ED途徑產生1 mol ATP［21］。因此，即使過表達單個基因，也可能對菌株的代謝網絡造成嚴重的擾動。（2）運動發酵單胞菌中特定基因的具體功能。ZMO1885編碼的NADH氧化酶及ZMO1211編碼的谷胱甘肽還原酶的過表達均未給細胞生長造成嚴重的干擾，由于NADH氧化酶為非核心的細胞氧化酶，有許多同工酶發揮作用，而谷胱甘肽還原酶在沒有抑制的條件下，對細胞生長并無直接關聯；ZMO1753編碼的NADP+還原酶的過表達顯著抑制菌株生長，這可能由于其影響胞內鐵氧還蛋白等重要物質的含量［22-24］。在2 g/L糠醛的條件下，若扣除基因改造對菌株生長的負面影響，ZMO1753過表達也略微提高了細胞對糠醛的耐受性。在釀酒酵母中，其磷酸戊糖途徑（Pentose phosphate pathway，PPP）和抗氧化性的關聯性也早已被證實，敲除PPP途徑中的關鍵基因，會導致其抗氧化性下降［25］。過表達PPP中的限速酶，提高NADPH的含量，而NADPH作為多種過氧化酶的重要輔因子協助其清除胞內ROS，從而提高菌株的耐受性［4，26］。

表6 對數生長中期（36 h）菌株在模擬木質纖維素水解液中發酵性能比較

圖4 模擬木質纖維素水解液中重組菌株ZM4/ZMO1885及對照菌株ZM4/20a糠醛和5-HMF轉化率

圖5 ZMO1885、ZMO1753、ZMO1211糠醛耐受性機理圖

NADH氧化酶對于微生物有氧生長過程中的抗氧化性已被證實［11-12］，如乳酸菌的有氧生長中該酶發揮著重要的抗氧化作用［13］。在光滑球擬酵母Torulopsis glabrata異源表達來源于乳酸菌Lactococcus lactisNADH氧化酶，可以有效降低NaCl誘導的ROS，減少ROS給細胞帶來的傷害，提高其高滲透壓耐受性［14］；而在釀酒酵母中異源表達L. lactis的NADH氧化酶也有類似的效果，降低了其有氧發酵條件下的ROS水平［15］?？啡T發細胞產生大量ROS，對細胞各種微結構造成損傷［6，27］。在2 g/L糠醛的條件下，ZMO1885過表達菌株糠醛耐受性顯著提升，歸因于NADH氧化酶去除ROS的能力。在含有多種抑制物的模擬木質纖維素水解液中，ZMO1885過表達菌株展示高耐受性能，與糠醛的單抑制物條件下的結論相一致。

NADH氧化酶催化NADH的氧化［15］，而NADH作為一種重要的還原性輔因子參與細胞中多種氧化還原反應［28-29］。NADH/NAD+的變化會給細胞生長帶來負面影響，或影響目標產物的生成［30-32］。在運動發酵單胞菌中，催化糠醛轉化為糠醇的脫氫酶或醛酮還原酶需消耗NADH或NADPH［33］。因此NADH氧化酶過表達引發胞內NADH水平大幅降低可能會干擾其他氧化還原酶，進而影響細胞生長和耐受性。在本實驗中，ZMO1885基因的過表達僅在轉錄水平發生有限倍數的上調，對胞內NADH/NAD+水平影響有限，該基因未造成胞內氧化還原失衡，并未影響細胞的生長狀態，但是其催化功能降低了ROS的含量，因此提高了菌株對于糠醛的脅迫耐受性。

4 結論

在運動發酵單胞菌中過表達NADH氧化酶基因ZMO1885，能夠在不干擾胞內NADH/NAD+水平的前提下，通過降低胞內ROS水平、強化糠醛的去除增強了菌株的糠醛耐受性。在模擬木質纖維素水解液中，重組菌株ZM4/ZMO1885的生長發酵性能顯著優于對照菌株ZM4/20a。