粟酒裂殖酵母蛋白Atp4定位和功能的研究

李琴 張琳琳 黃鷹

（南京師范大學生命科學學院，南京 210023）

線粒體是細胞內代謝活動的主要中樞，參與多種重要的細胞過程，包括鐵硫簇的生物合成，鈣穩態和細胞凋亡等。氧化磷酸化產生ATP是線粒體最重要的作用，該過程需要五個多亞基蛋白質復合物；其中四個構成線粒體呼吸鏈并參與電子傳遞過程，電子轉移在線粒體內膜上產生質子梯度，最后被復合物V（ATP合成酶）利用以合成ATP［1-3］。由于線粒體結構和功能固有的復雜性，線粒體功能障礙與諸多的人類疾病有關，例如糖尿病、肥胖癥、心血管疾病、癌癥，以及線粒體功能衰老［4-7］。其中，復合體V中ATP合酶的缺乏會導致心肌病、腦病和白內障等疾?。?-9］。

釀酒酵母的ATP合成酶由至少13種不同種類的亞基組成，5個亞基（α3β3γδ和ε）組成酵母F1，F0 包含 8 個不同的亞基（4、OSCP、d、h 和 f）［10］。通過pombase數據庫分析，粟酒裂殖酵母中Atp4被預測為線粒體ATP合酶F0的組成蛋白，參與線粒體的能量代謝過程并與線粒體ATP的產生密切相關。它在人和芽殖酵母中的同源蛋白，分別ATP5PB和ATP4。芽殖酵母中ATP4是核基因編碼的大小為25 kD的ATP合酶亞基4。人們發現ATP4是F0的一個定子，參與F0F1-ATP合酶的組裝，功能上與ATP合酶的二聚體的形成，維持內膜嵴的形狀和ATP合酶的磷酸化有關［11-12］。在人中，核基因編碼蛋白ATP5PB成為線粒體ATP合酶F1-F0的亞基b，與酵母線粒體ATP4的同源性為31%［13-14］。通過同源比對發現裂殖酵母Atp4與人中ATP5PB的同源性達到64%，預測Atp4參與線粒體功能發揮，而且到目前為止，在粟酒裂殖酵母中還沒有Atp4功能的研究。因此本文旨在探究粟酒裂殖酵母中Atp4參與線粒體功能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 粟酒裂殖酵母單倍體菌株 yHL6381（h+，his3-D1，leu1-32，ura4-D18，ade6-M210）、 大 腸 桿 菌Escherichia coliTop10、pFA6a-KanMX6、pYJ19為本實驗室保存。

1.1.2 培養基 YES培養基：酵母粉5 g/L，葡萄糖 20 g/L，adenine、histidine、uracil、leucine 各 200 mg/L，2%瓊脂粉（固體）；YES+6%、3%甘油：每100 mL YES培養基加入12 mL、6 mL 50% 甘油；LB培養基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，1.5%瓊脂粉（固體）；LBAMP+培養基：每100 mL LB培養基加入氨芐青霉素鈉（終濃度0.1 mg/mL）；EMmLeu-（Edinburghminimal medium） 培養基：鄰苯二甲酸氫鉀3 g/L，十二水合磷酸氫二鈉5.55 g/L，氯化銨5 g/L，10 mL 100×salt stock，1 mL 1 000×vitamin，0.1 mL 10 000×mineral stock，adenine、uracil、histidine各 225 mg/L，葡萄糖 20 g/L，2%瓊脂粉（固體）。葡萄糖單獨滅菌。

1.1.3 儀器和試劑 限制性內切酶、PrimeSTAR DNA Polymerase、PCR反應試劑和連接酶均購自Takara；PCR引物由南京捷瑞合成；DNA Marker購自南京百思凱；DNA純化和割膠回收試劑盒購自南京博巧；SDS、HEPES、Sorbitol、Tris、30%丙烯酰胺等試劑購自上海生工，尼龍膜購買于GE。主要儀器有PCR儀，臺式高速離心機，Odyssey雙色紅外激光成像系統，電泳槽等。

1.2 方法

1.2.1 Δatp4菌種構建 以pFa6a-kanMX6為出發質粒，以yHL6381酵母基因組為模板擴增得到up-同源臂以及down-同源臂。將up-同源臂構建到質粒上游酶切位點SalI和BglII間，down-同源臂構建到質粒下游EcoRI和EcoRV間。設計引物將up-同源臂、抗性標簽、down-同源臂擴增得到單一目的條帶后，醋酸鋰轉化到yHL6381內通過同源重組敲除基因atp4。

1.2.2 點板實驗 實驗前3 d將菌種yHL6381和Δatp4于固體平板YES上劃線活化。將活化菌種接種至培養基內，過夜培養。第二天將種子液重新轉接到10 mLYES液體培養基內，并將OD都調至0.2左右，于搖床，30℃，200 r/min，培養12 h。將yHL6381和Δatp4菌液初始OD均調至3左右，按10 倍梯度依次稀釋為 1、10-1、10-2、10-3、10-4。取2.5 μL點圈于甘油平板上。30℃，倒置平板培養3-5 d。拍照。每塊平板重復3份，整個實驗重復3次。

1.2.3 Atp4定位預測分析 粟酒裂殖酵母數據庫pombase顯示Atp4定位于線粒體，通過網站Mitoprot II（https：//ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.htmL） 分析Atp4的氨基酸序列是否具有線粒體定位序列，預測Atp4 N-端前29個氨基酸為線粒體定位序列：METSSKLSPVQRTTAAWQRLLPSTRFSL，序列可信度為56.13%。因此我們推測Atp4定位于線粒體內。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察Atp4定位 取質粒pYJ19-atp4-GFP用NruI進行單酶切，酶切完后熱失活處理，取1 μg通過LiAc導入到yHL6381內，涂布于EMM（Ade，His，Ura）篩選平板上。3-4 d后挑選大小合適的轉化子在EMM篩選平板上劃線。2 d后將菌株接種于相應的篩選培養基內，過夜后轉接至OD600=0.2，培養至OD600=0.6左右，收菌，PBS緩沖洗一次后，加入Mitotracker染料常溫染色2-3 min后，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 線粒體定位實驗 實驗以Tom20（線粒體外膜蛋白）和Hsp60（線粒體基質蛋白）為對照。分別用TritonX-100和蛋白酶K處理線粒體，TritonX-100將線粒體外膜消解而使得蛋白暴露于蛋白酶K環境下被其水解。堿性碳酸鈉使線粒體膜打開釋放內容物，位于基質的蛋白分布在上清中，而線粒體膜蛋白則分布在沉淀內。用不同處理并與對照蛋白相對應，從而確定目的蛋白的定位。

1.2.6 Western blotting檢測線粒體蛋白表達量 分別提取純化Δatp4和yHL6381線粒體，并用BCA法測取濃度。取等量的線粒體分別進行以下處理：100℃煮 10 min用以 檢 測 Cox2、Cox4、Atp6和 Hsp60；45℃水浴3 min用以檢測Cox1、Cob1和Cox3。將處理后的線粒體蛋白上樣于12% SDS-PAGE，80 V電泳30 min，120 V電泳90 min。轉膜300 mA，100 min。5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗常溫孵育2 h。二抗常溫避光孵育1 h。Odyssey Infrared Imaging檢測實驗結果。

2 結果

2.1 重組質粒的構建及酶切驗證

Δatp4的構建和驗證：選擇atp4編碼區前384 bp作為上游同源臂和編碼區后面550 bp作為下游同源臂，進行PCR擴增和酶切驗證（圖1-A-B）；將上游同源臂+KanMX+下游同源臂的融合片段導入yHL6381內，挑選轉化子進行PCR驗證，野生型為2 305 bp，轉化子為2 504 bp（圖1-C）；atp4-flag的構建和驗證：選擇atp4編碼區前面和后面約500 bp作為上、下游同源臂（圖1-D）；上、下游構建酶切驗證（圖1-E）；將上游同源臂+Flag+下游同源臂的融合片段導入yHL6381內，挑選轉化子進行PCR驗證，野生型為1 449 bp，轉化子為3 510 bp（圖1-F）。

2.2 Δatp4菌株的表型研究

為研究敲除菌的表型，構建了Δatp4菌株并在以葡萄糖或甘油為唯一碳源的YES固體培養基上點圈，以yHL6381為陰性對照。結果（圖2）顯示，在YES發酵平板上，敲除菌株和野生型菌株生長狀況一致。在含3%和6%甘油非發酵平板上，Δatp4菌株的生長明顯減緩。說明atp4基因的敲除使得菌株呼吸缺陷，從而使線粒體蛋白功能發揮異常。

圖1 重組質粒的構建與驗證

圖2 Δatp4在甘油平板上的生長情況

2.3 Atp4的定位研究

2.3.1 熒光顯微鏡觀察 利用GFP追蹤Atp4，Mitotracker追蹤線粒體以確定蛋白定位。Atp4-GFP在顯微鏡下發出綠色熒光（圖3），Mitotracker染色顯示線粒體部分為紅色。將兩者進行磨合后，重疊部分顯示為黃色。結果表明，Atp4定位于線粒體。

圖3 Atp4-GFP的熒光顯微鏡觀察

2.3.2 TritonX-100和蛋白酶K處理 為了進一步研究Atp4定位在外膜還是內部，選擇Tom20（線粒體外膜蛋白）和Hsp60（線粒體基質蛋白）作為對照。結果（圖4）顯示，Atp4不定位于線粒體外膜，可能定位于線粒體基質或者內膜。

圖4 TritonX-100和蛋白酶K處理線粒體后蛋白情況

2.3.3 堿性碳酸鈉處理 Atp4定位于線粒體基質或內膜，接下來利用堿處理線粒體確定定位。以Cox2（內膜蛋白）和Hsp60（線粒體基質蛋白）作為對照。結果（圖5）顯示，Atp4主要分布在沉淀中，上清中只有少量，與內膜蛋白Cox2相同。表明Atp4定位于線粒體內膜。

圖5 堿性碳酸鈉處理線粒體后蛋白情況

2.4 Atp4缺失導致線粒體呼吸鏈蛋白表達降低

粟酒裂殖酵母的線粒體中僅合成了8種主要蛋白質，包括呼吸復合體III（Cob1），IV（Cox1，Cox2，Cox3）和V（Atp6，Atp8和Atp9）的亞基和核糖體蛋白小亞基（Var1）［15-16］。上述實驗已經證明atp4定位于線粒體，因此我們檢測了由線粒體編碼的蛋白（Cob1、Cox1、Cox2、Cox3、Atp6）以及由核編碼的定位于線粒體的蛋白Cox4，以內參Hsp60作為上樣控制。

Western blotting結果（圖6）顯示，相較于yHL6381菌株，Δatp4菌株內線粒體蛋白Cob1、Cox1、Cox2、Atp6表達量明顯下降，Cox3和Cox4蛋白表達量也相應有略微下降。這表明atp4缺失影響了線粒體編碼的電子傳遞鏈蛋白的表達，從而影響了線粒體呼吸鏈復合體的組裝。結合點圈結果顯示的Δatp4菌株在非發酵型培養基上出現了生長抑制的現象，判斷該現象是由于該基因的缺失導致線粒體蛋白表達量降低而不能正常氧化磷酸化造成的。

圖6 Western blotting檢測Δatp4菌株中線粒體相關蛋白質表達量

3 討論

芽殖酵母缺失ATP4突變菌株，在非發酵培養基上出現了生長缺陷，這是由于影響了ATP合酶的正常組裝導致的［17-18］。ATP4包括TM1（25-46 aa）和TM2（56-76 aa）以及中間環（47-55 aa）。其中，缺失中間環，引起了線粒體形態變化（嵴呈現為細長的片狀）［19-20］；破壞C-端親水結構域，其突變菌株的氧化磷酸化功能喪失，ATP合酶與膜的結合也變得松散［21］。本文研究發現粟酒裂殖酵母Δatp4菌株在非發酵培養基上表現出呼吸缺陷；通過熒光觀察和生化處理線粒體實驗得出Atp4是在線粒體內膜上發揮功能，因此推測Atp4可能參與線粒體呼吸鏈蛋白亞基的組裝和ATP的產生。通過Western blotting實驗結果表明缺失Atp4引起了Cob1、Cox1、Cox2、Atp6表達量劇烈下降，說明Atp4的缺失不僅僅影響了復合體V的組裝也使得上游呼吸鏈復合體III和IV發生解離。

芽殖酵母的ATP4與裂殖酵母的Atp4為同源蛋白，通過Blast氨基酸序列比對分析得出，序列同源性大約是82%，但是N端前40個氨基酸并不保守。ATP4在芽殖酵母中是F0組成蛋白，對于ATP合酶的正常組裝和氧化磷酸化的進行十分重要。在粟酒裂殖酵母內Δatp4菌株出現呼吸缺陷，線粒體蛋白表達量劇烈下降。Atp4對于粟酒裂殖酵母正常氧化磷酸化是必不可少的。但是Atp4缺失是影響蛋白的正常合成還是穩定仍需要進一步研究。

4 結論

表型研究發現粟酒裂殖酵母atp4缺失后菌株出現生長缺陷。熒光顯微鏡觀察和生化試劑TritonX-100和蛋白酶K處理以及堿性碳酸鈉處理線粒體實驗證明Atp4定位于線粒體內膜。Western blotting檢測結果表明Atp4缺失菌株內線粒體基因組編碼蛋白Cob1、Cox1、Cox2和Atp6 表達量降低。