與內生真菌共培養對葡萄果肉細胞生理生化影響的差異研究

禹滿 陳競超 瞿巾卓 劉芳 潘小霞 楊明摯

（1. 云南大學生命科學學院，昆明 650000；2. 云南大學農學院，昆明 650000）

植物內生真菌（Endophytic fungi）是指整個或部分生活史存活于健康植物各種組織和器官內部，且不引發宿主植物明顯病害癥狀的真菌［1］。在大多數情況下，內生真菌與植物之間是互惠共生的，一方面內生真菌通過植物體獲得營養物質、庇護和傳播；另一方面植物內生真菌可通過產生生物活性物質或借助信號轉導對宿主植物提供保護，增強植物抗病、抗蟲、抗干旱脅迫等能力［2］。已有研究表明，內生真菌能夠產生次生代謝產物如萜類、生物堿、黃酮類和苯丙素類等［3］；1994年朱至清等［4］首次報道從云南紅豆杉樹皮中分離出一株可以合成紫杉醇的內生真菌；王曉龍［5］對懷山藥優勢內生真菌的次生代謝產物進行研究，分離鑒定出8個化合物分別屬于甾體、生物堿、脂肪酸及脂肪酸酯類成分。由于宿主不同內生真菌產生的次生代謝產物也不同，不僅可以產生與宿主相同或相似的次生代謝產物，而且還能產生宿主中不具備的新化合物，如苦馬豆素（Swainsonine，SW）活性分子。SW是一種有毒生物堿，存在于豆科苦馬豆屬、黃芪屬和棘豆屬等多種植物中，可引起牲畜中毒。近年來研究發現SW的真正生產者是這些宿主植物的內生真菌［6］。這些研究結果表明了植物內生菌對宿主植物具有不可忽視的生理生化和代謝效應。

自然條件下由于與植物內生真菌菌群結構的復雜性和種類的多樣性，許多與植物共生的內生真菌類群，以及內生真菌與宿主植物間的相互作用關系并未被完全闡明［7］。利用離體培養的植物細胞和分離純培養的內生菌株建立有效的共培養體系，為探索特定內生菌菌株和植物細胞在生理生化層面的相互作用提供了一種可控的研究模型［8］。有研究從盾葉薯蕷根狀莖中分離到一株內生真菌可以與盾葉薯蕷愈傷組織協調生長［7］。目前已有研究證明通過施加內生真菌能夠改變葡萄的生理生化品質。黃麗華［9］通過對峙培養法建立了葡萄細胞與內生真菌的共培養體系表明兩者共同培養能夠調控愈傷組織理化性質；張秀英［10］通過研究葡萄細胞對內生真菌誘導子的理化響應證實了內生真菌提取物對植物細胞能夠產生影響。但是關于葡萄內生真菌直接接觸葡萄細胞的共培養方式所帶來的生理生化響應目前尚不清楚。

本研究將分離自葡萄葉片的不同內生真菌菌株直接接種于具有合成花色苷能力的葡萄果肉細胞上，構建葡萄細胞與內生真菌的共培養體系，在細胞水平上研究與不同內生真菌共培養對葡萄細胞生長及類黃酮代謝途徑影響的差異性。研究結果除了發掘到一批具有進一步研究和利用價值的內生真菌資源外，同時也為從龐大數量的內生菌中篩選具有不同潛在應用價值的內生菌資源提供必要方法和技術。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：選取本實驗室從赤霞珠（Vitis vinifera）、玫瑰蜜（V. ViniferaL.×V. labruscaL.）、夏黑葡萄（V. ViniferaL.×V. labruscaL.）的葉片中分離出的內生真菌菌株；各菌株在前期試驗中已經通過形態和分子鑒定。本次試驗共選取了47株內生真菌，18個屬，其中鏈格孢屬6株，附球菌屬8株，黑孢霉屬4株，鐮刀菌屬4株，刺盤孢屬6株，間座殼屬、毛殼菌屬、葡萄座腔菌屬、炭層菌屬、炭團菌屬各2株，單端孢屬、多節孢屬、截盤多毛孢屬、莖點霉屬、球座菌屬、亞隔孢殼屬、多孢菌屬、擬盤多毛孢屬各1株和1株未能歸屬的菌株（表1）。

供試葡萄細胞：材料選用生長旺盛且長勢一致紫色佳美果肉愈傷組織，并已繼代培養5代以上。繼代培養基為GS+0.2 mg/L KT+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7.6 g/L瓊脂，pH為5.8。培養條件：25±2℃恒溫箱中暗培養，約25 d繼代1次。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌與葡萄愈傷組織的共培養體系構建 選取同一代相同來源且生長良好的愈傷組織1 g左右，接種于含葡萄細胞繼代培養基的培養皿正中央，25±2℃條件下放入無光條件下培養7 d，同時將供試菌株置于PDA培養基上培養5 d左右，然后用蘸了無菌水的解剖針輕微蘸一下生長良好的相應菌株的菌落，接種于愈傷組織上，每個處理7個重復。愈傷組織對照以同樣方式接種無菌水，內生真菌對照接種相應內生真菌不接種愈傷組織，以檢測接種是否成功的陽性對照。從接種內生真菌后至接種后第6天，每天觀察和統計愈傷組織褐化情況。并在共培養培養第6天后取出愈傷組織與內生真菌的共生體，液氮處理后置于-80℃冰箱中保存待用。

表1 試驗中使用內生真菌菌株

1.2.2 葡萄細胞的生理生化指標分析 葡萄細胞增殖倍數（CIM）=（W樣-m）/m

式中：W樣為葡萄愈傷組織與內生真菌的共生體的質量（g）；m為初始接種葡萄愈傷組織的質量（g）。

1.2.2.1 葡萄細胞花色苷總量的測定 稱取一定量鮮細胞（0.4 g左右），加入1 mL花色苷提取液（15%鹽酸（1.5 mol/L）-乙醇溶液）研磨，然后用花色苷提取液定容至5 mL，室溫下超聲提取30 min，離心（4℃，5 000 r/min，15 min），上清液即為花色苷提取液。花色苷的測定用分光光度計采用pH示差法測定。取兩份1 mL的花色苷提取液，分別用pH 1.0 KCl和pH 4.5 CH3COONa緩沖液定容至6 mL，待反應平衡后（約60 min），用分光光度計分別測定兩份溶液在700 nm和最大吸收峰波長535 nm處的吸光度值，以蒸餾水代替提取液做對照。花色苷總量用TAC（Total anthocyanins content）表示，通過以下公式計算各樣品中花色苷含量［11］：

式中：ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數為26 900 L/mol /cm；L為比色皿的寬度（1 cm）；Mw為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子質量449.2 g /mol；DF為稀釋倍數；V為提取液體積（mL）；m為樣品鮮重（g）。

1.2.2.2 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定方法 準確稱取一定量愈傷組織細胞，加入少量PVP，1 mL預冷的0.05 mol/L pH 8.7硼酸緩沖液，迅速研磨后定容至5 mL，離心（4℃，10 min，8 000 r/min）。上清液即酶液。酶反應體系：0.05 mol/L pH 8.7硼酸緩沖液4 mL、0.02 mol/L苯丙氨酸溶液1 mL，酶液1 mL，40℃水浴反應1 h后，加入0.2 mL 6 mol/L HCl終止反應，以硼酸緩沖液代替酶液做為空白，在290 nm下測定OD值［10］：

式中：V1為提取酶液的總體積（mL）；V2為測定時取用酶液體積（mL）；m為樣品鮮重（g）；t為反應時間（min）。

1.2.3 數據分析 運用Excel整理數據，制作圖表，并用IBM SPSS Statistics 22.0軟件對共培養后葡萄細胞的生理生化指標進行單因素方差分析，以及共培養后葡萄細胞的生理生化響應指數對試驗所用不同內生真菌進行聚類分析。對葡萄細胞的褐化類型進行數字化標記：正常葡萄細胞標記為0，輕度褐化標記為1，中度褐化標記為2，高度褐化標記為3。其中葡萄細胞某指標的響應指數RI =（該指標樣品測量值-該指標對照平均值）/該指標對照平均值。

2 結果

2.1 與不同內生真菌共培養能引起葡萄細胞不同程度的褐化

與不同內生真菌菌株共培養后可以引起葡萄愈傷組織表現出不同程度的褐化作用，依據引起的愈傷組織褐化程度分成正常（未褐化）、輕度褐化、中度褐化、高度褐化4個等級（圖1）。所有參與測試的菌株中有12株內生真菌未造成細胞的明顯褐化，8株內生真菌引起細胞輕度褐化，4株內生真菌造成細胞中度褐化，23株內生真菌造成細胞高度褐化（表2。從菌株所屬真菌屬的層面分析發現，6株鏈格孢屬（Alternaria）中4株未引起愈傷組織的褐化或者只引起輕度褐化，只有菌株RH-6引起葡萄細胞高度褐化。8株附球菌屬（Epicoccum）中5株未引起愈傷組織的褐化或者只引起輕度褐化，菌株RH-38和MDR-17引起葡萄細胞高度褐化。4株黑孢霉屬（Nigrospora）中只有菌株MDR-1引起葡萄細胞高度褐化，其余未造成愈傷組織的褐化或者只導致輕度褐化。所有鐮刀菌屬（Fusarium）均會造成細胞中度或者高度褐化。6株刺盤孢屬（Colletotrichum）中只有RH-48未造成細胞褐化，其余均引起葡萄細胞中度或高度褐化。

圖1 與內生真菌共培養后引起愈傷組織的不同程度的褐化類型

表2 與不同內生真菌共培養造成葡萄細胞不同褐化程度的菌株歸類

2.2 共培養對內生真菌和葡萄細胞生長的相互影響

不同內生真菌菌株在葡萄愈傷組織上的生長狀態差異巨大（表3）。6株內生真菌在本次使用的細胞上未生長（同樣方式直接接種到培養基上的相應內生真菌正常生長），對愈傷組織的生長和形態影響不明顯。18株內生真菌在與細胞共培養6 d后菌落面積未達到細胞面積的一半，大部分菌株未引起愈傷組織的褐化或僅出現輕度褐化，只有菌株MDR-32（Colletotrichum boninense） 和 B-32（Truncatellasp.）使愈傷組織高度褐化。23株內生真菌在與細胞共培養6 d后菌落面積超過細胞面積的一半，并導致愈傷組織的嚴重褐化。接種不同內生真菌對葡萄細胞的生長有不同程度的影響。葡萄細胞與內生真菌共培養后，有6株內生真菌顯著（P＜0.05）促進了葡萄細胞的生長（圖2），分別為：MDR-16（Epicoccum sorghinum）、RH-7（Epicoccumnigrum）、B2-17（Alternariasp.）、MDR-28（Fusariumgraminearum）、MDR-6（Nigrosporasp.） 和 B2-23（Pestalosphaeriasp.），其中菌株MDR-6對愈傷組織生長的促進作用最大，與對照相比增加了98.67%；6株內生真菌顯著抑制了葡萄細胞的生長，分別為RH-37（Epicoccum nigrum）、RH-34（Trichothecium roseum）、MDR-37（Colletotrichumsp.）、MDR-30（Guignardia mangiferae）、MDR-44（Botryosphaeria dothidea） 和MDR-14（Phomasp.），其中菌株MDR-37對愈傷組織生長的抑制作用最嚴重，與對照相比增殖減少了100%。其余的菌株對細胞生長無顯著差異。

表3 共培養對內生真菌和葡萄細胞生長相互影響程度的內生真菌菌株歸類

2.3 與不同內生真菌共培養對葡萄細胞PAL活性和花色苷含量的影響

大部分葡萄細胞的PAL活性在與內生真菌共培養后與對照相比差異不顯著（P＞0.05），僅少部分與內生真菌菌株共培養不同程度地提高了葡萄細胞中PAL的活性，與內生真菌菌株MDR-23、RH-38、MDR-17、RH-37、MDR-44、RH-28 和 MDR-6的共培養引起葡萄細胞PAL的活性被顯著（P＜0.05）提高； 與 CWR-49、MDR-16、CWR-47和 RH-34四株菌的共培養極顯著的（P＜0.01）提高了葡萄細胞PAL活性，其中菌株RH-34對PAL活性提高最多，與對照相比提高了77.80%。與不同內生真菌培養后大部分葡萄細胞的花色苷總量均被不同程度的降低，其中菌株MDR-1、MDR-23、CWR-49對葡萄細胞花色苷的合成抑制作用最大，與對照相比降低了100%。與菌株XHYN-2、RH-7、R2-21、XHCN-3和MDR-7共培養提高了葡萄細胞花色苷的總量，但未達到顯著水平；與菌株B2-17、XHCN-1和B2-23 共培養后葡萄細胞花色苷含量與對照相比無顯著差異（圖 2）。

2.4 基于細胞生理生化響應對共培養內生真菌菌株的聚類分析

以共培養后葡萄細胞的生理生化響應值（RI）為分類依據對試驗所用不同菌株進行系統聚類（組間連接）。聚類分析結果（圖2）表明，所研究的47株內生真菌整體上被劃分為兩大類群：Ⅰ類群包括41株內生真菌，它們與葡萄細胞共培養后大部分會引起細胞褐化；Ⅱ類群包括6株內生真菌，與葡萄細胞共培養后細胞未褐化仍處于正常生長狀態且對葡萄細胞花色苷總量無顯著影響。Ⅰ類群可進一步分為A、B、C、D四組，A組絕大多數菌株使葡萄細胞高度褐化，細胞增殖倍數較低，同時使葡萄細胞花色苷總量極顯著降低；B組菌株使細胞中度褐化，促進了細胞的增殖；C組包括4株內生真菌，僅引起葡萄細胞輕度褐化或未褐化，且對葡萄細胞的增殖有一定的促進作用；D組菌株均未引起葡萄細胞褐化，對葡萄細胞的增殖以及酶活性均無顯著影響，但對葡萄細胞花色苷總量具有極顯著的抑制作用。將Ⅱ類群進一步分為E、F、G三組，E組菌株對葡萄細胞花色苷總量和PAL活性均無顯著影響，對細胞增殖有不同程度的促進作用；F組和G均只包含一株內生真菌，分別是XHCN-3和XHYN-2，與葡萄細胞共培養后均提高了葡萄細胞的花色苷總量，其他指標與對照相比均無顯著差異。

3 討論

內生真菌對植物的影響是多方面的，部分內生真菌有著調控宿主植物生長以及次生代謝途徑的生物特性［12］。熊玉萍［13］從地黃內生真菌中篩選出3株能夠顯著促進植株的生長及生物量的內生真菌；內生真菌還可通過提高植物的葉綠素質量分數，增強光合作用，進而促進植物的生長［14-15］；Peters等［16］將內生真菌與植物細胞進行共培養，發現內生真菌會顯著促進植物細胞的生長。此外，由于與宿主植物長期共存，內生真菌與宿主具有相同或相似的生物合成途徑，內生真菌不僅可以自身產生次級代謝產物，如楊夢莉等［17］從燈盞花內生真菌中分離出能夠產黃酮類物質的內生真菌；Liu等［18］從赤霞珠葡萄葉片中分離出一株可以產白藜蘆醇的內生真菌；而且還可以調控植物次生代謝途徑，李群等［19］從灰氈毛忍冬‘渝蕾1號’中分離出6株內生真菌的誘導子在某些濃度下能顯著地提高‘渝蕾1號’懸浮細胞中綠原酸的含量；再接種內生真菌能夠提高葡萄葉片和果實的還原糖、總酚、總黃酮和白藜蘆醇的含量［20］；黃麗華等［9，21］通過構建內生真菌 -離體細胞對峙共培養體系發現部分內生真菌不僅可以顯著提高葡萄細胞總酚、總黃酮的含量且使葡萄細胞產生新的化合物。這些研究說明內生真菌的存在會影響植物及植物細胞的生理生化指標。目前已有研究建立了內生真菌與葡萄細胞分開培養的對峙共培養體系，但是對于內生真菌與葡萄離體細胞直接接觸的共培養試驗還沒有相關的研究。

本實驗在細胞水平上建立愈傷組織與內生真菌直接接觸的共培養體系，旨在構建可行的共培養體系并探索內生真菌與植物細胞共培養的相互作用機理及篩選出具有不同利用價值的內生真菌資源。研究發現與內生真菌共培養會造成葡萄細胞不同程度的褐化，按照植物內生真菌的存在不會對葡萄植株產生明顯病害癥狀的定義來看，造成與內生真菌共培養葡萄細胞不同程度褐化的原因可能是因為適宜在葡萄愈傷組織上生長的內生真菌，相對生長較快，因此對葡萄細胞的傷害較大，褐化程度也會相對較大。細胞的增殖也會因為褐化而受到抑制，且褐化的葡萄細胞花色苷總量會被降低，但PAL活性要高于未褐化的，這可能是因為褐化后葡萄細胞次生代謝產物發生了改變，PAL作為次級代謝途徑的關鍵酶，其活性的提高有利于植保素（黃酮、酚類等）的積累有助于植物抵抗外界不利因素的侵襲［22］。而在葡萄細胞上生長較慢的內生真菌基本不會造成細胞褐化，且葡萄細胞的生長、花色苷含量以及PAL活性不會受到顯著的抑制作用，這可能是因為葡萄細胞未受到較大的傷害其生長及次生代謝均可正常進行。

圖2 葡萄細胞與不同內生真菌共培養后生理生化響應指數及基于葡萄細胞生理生化相應的內生真菌聚類分析

4 結論

選取18個屬47株內生真菌與佳美葡萄（Vitis vinifera L.cultivar：Gamay）愈傷組織進行共培養。結果表明，接種不同內生真菌對葡萄細胞的生長有不同程度的影響，與菌株MDR-16、RH-7、B2-17、MDR-28、MDR-6和B2-23共培養對葡萄細胞增殖具有顯著促進作用。與菌株R-19、MDR-39、RH-24、MDR-12、MDR-7、B2-23、MDR-16、MDR-6、MDR-13、R2-30、RH-48、CXC-16、R2-9、MDR-15、B2-17、RH-7、R2-21、XHCN-1、XHCN-3和XHYN-2共培養后對葡萄細胞的傷害作用較小；與菌株XHYN-2、RH-7、R2-21、XHCN-3和MDR-7共培養能夠提高葡萄細胞花色苷的含量；與菌株MDR-16和MDR-6共培養既能顯著促進葡萄細胞的生長又能顯著提高葡萄細胞PAL活性。