一種耐鹽促生菌篩選、鑒定及對玉米幼苗生長的影響

孫培 王罡 張亞楠 李倩 季靜 楊丹 袁東 王暢 王昱蓉 王萍

（1. 天津大學環境科學與工程學院，天津 300000；2. 天津市天大天福生物技術有限公司，天津 300000）

近年來，由于全球氣候的變化，土壤鹽漬化已成為日益嚴峻的環境問題。高鹽作為一種主要的非生物脅迫［1］，對植物會產生滲透脅迫、質膜傷害、離子不平衡以及代謝紊亂等傷害，從而抑制植株的生長［2］。玉米（Zea maysL.）是世界上重要的糧食作物之一，廣泛地用于畜牧業、工業以及養殖業等產業［3］。但是玉米耐鹽性較差［4］，這極大限制了玉米在鹽漬化土壤上的生長，制約了全球玉米的生產與發展，因此提高鹽漬化土地上玉米的產量及質量，是我國科研工作者首要的任務之一。

根際促生菌能在一定程度上提高植物對干旱，高鹽和高溫等非生物脅迫的耐受性。Jiang等［5］分離出4種溶磷菌株，包括巨芽孢桿菌（YM13）、腸桿菌（YM14）、普羅維登氏菌（TPM23）和青貯黏液桿菌（TPMX5），研究表明這4種菌在鹽脅迫下具有高效的溶磷性，能夠提高花生的生物量，對花生的生長具有促進作用。Lucio等［6］從油菜根際篩選分離得到芽孢桿菌LTAD-52，該菌能夠溶磷，可以增加油菜莖的干重，將油菜的產量從21%提高到44%。研究表明，在200 mmol/L的氯化鈉濃度下，將從紫蘇根際分離的黃色葡萄球菌F-11、黃志亨柳菌F-9以及巨芽孢桿菌F-58接種在玉米幼苗根際，這些菌都可以顯著減輕玉米幼苗受到的鹽脅迫；F-11可以顯著增加玉米幼苗的莖長和根長，最多增加一倍，F-9和F-58可以分別增加玉米鮮重45%和42%［7］。因此，利用根際促生菌可以減緩農作物受到的脅迫，為微生物開辟了一個新興的利用途徑。

本實驗用10%的鹽濃度培養基從玉米根際土壤篩選耐鹽促生菌并驗證其促生性。通過盆栽實驗，用不同的方式處理玉米幼苗，測定幼苗生長及生理指標。探究耐鹽促生菌提高玉米幼苗的耐鹽性以及促進玉米幼苗生長的機制，以期獲得在鹽漬化土壤中能夠促進玉米生長的根際耐鹽促生菌，促進玉米在鹽漬化土壤中的生長。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品的收集 土壤樣品來自于天津大學試驗田種植的玉米根際土壤，將玉米連根拔起，輕輕抖動去除非根際土，用無菌水將玉米根際土沖下并收集，4℃保存待用［8］。

1.1.2 培養基 基礎 LB液體培養基：蛋白胨5.0 g，酵母提取物10.0 g，NaCl 10.0 g，用ddH2O溶解并定容至1 L。基礎LB固體培養基：在基礎LB液體培養基中添加瓊脂粉15.0 g。無機磷培養基：葡萄糖 10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，NaCl 0.3 g，Ca3（PO4）210.0 g， 瓊脂 15.0 g，用ddH2O 溶解并定容至1 L，pH值7.0-7.5。有機磷培養基：葡萄糖 10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，NaCl 0.3 g，CaCO35.0 g，卵磷脂 0.2 g，瓊脂 15.0 g，ddH2O 1 L，pH 值 7.0-7.5［9］。

1.1.3 供試玉米種子 本實驗室保存的兩種不同品系的玉米種子，分別為優良玉米自交系1666和7922，分別記作品系1和品系2。

1.2 方法

1.2.1 根際耐鹽促生菌的分離 稱取玉米根際土壤樣品5 g（濕重），放入已滅菌的裝有100 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，置于搖床，震蕩培養20 min（30℃、160 r/min）。吸取1 mL上清液放入已滅菌的試管中，加入9 mL無菌水稀釋。用接種環蘸取上述稀釋液，并分別在鹽濃度為5%、6%、7%、8%、9%和10%的LB固體平板上進行劃線。將上述平板置于30℃的恒溫培養箱中培養24 h。選取不同鹽濃度下LB平板中具有相同形態的菌落作為初選耐鹽促生菌落，挑取鹽濃度為10%固體LB平板中的初選耐鹽菌落接種到鹽濃度為10%的LB液體培養基中，在30℃進行富集培養24 h。將富集菌液稀釋100倍，用接種環蘸取稀釋液并接種于鹽濃度為10%的LB固體培養基中，進行劃線培養，培養溫度為30℃，培養時間為24 h。取上述長勢良好的單菌落進行后續實驗。以上實驗操作均在無菌條件下進行。

1.2.2 根際耐鹽促生菌的生理生化及分子生物學鑒定 根據《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版）和《常見細菌系統鑒定手冊》對根際耐鹽促生菌進行形態學觀察和生理生化鑒定［10-11］。

采用SDS-CTAB法提取耐鹽促生菌總DNA［12］。以提取的總DNA為模板，用細菌通用引物27F，5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R，5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進 行PCR擴 增，將PCR擴增產物送至金唯智公司測序。測序結果用DNAMAN進行拼接，將拼接好的序列去掉兩端引物后，提交EzBioCloud數據庫中的Identify程序（https：//www.ezbiocloud.net/identify）進行比對，找出與所測菌株序列同源性較高的模式菌株類型，下載該菌株的16S rDNA序列，利用MEGA6.0中的Neighbor-joining analysis構建系統發育樹。

1.2.3 根際耐鹽促生菌溶磷特性的測定 將根際耐鹽促生菌接種在無機磷和有機磷固體培養基上，在30℃培養5 d后觀察。

1.2.4 盆栽實驗 用無菌水將種子浸泡24 h。將保存的菌種在基礎LB培養基中進行活化，并在搖床中培養至OD600值為0.6-0.8，離心，去上清，將沉淀菌體用無菌水重懸，即得到處理種子的菌液。營養土和蛭石配比為1∶1，121℃滅菌1 h。盆栽試驗設計，在托盤中放入蛭石，將預處理的種子進行萌發，待幼苗長至兩葉一心時，選取長勢一致的幼苗移栽至花盆中，每盆移2株，移栽時記錄幼苗的根長和株高，并把幼苗移栽至相同高度。4種處理組合如下：空白對照組：不加菌，不加鹽，記作CK組。加菌組：加菌，不加鹽，記作CB組。加鹽組：不加菌，加鹽，記作CS組。加菌加鹽組：加菌，加鹽，記作CBS組。其中：加菌方式為根灌方式，每次在根際周圍澆1 mL的處理種子菌液，每隔2 d澆一次；不加鹽方式為植株澆無菌水，加鹽方式為植株澆150 mmol/L的無菌鹽溶液。每種組合3次重復，室溫培養，每個托盤每次澆1.5 L的水或鹽溶液，每隔3 d澆一次水，室溫培養15 d后，分別進行生長生理指標的測定。

1.2.5 玉米幼苗生長生理指標的測定

1.2.5.1 株高和根長變化量的測定 測量移栽前和移栽后培養15 d后的株高和根長，并計算株高和根長變化量。

1.2.5.2 葉綠素含量的測定 取0.1 g新鮮葉片置于10 mL離心管中，加入5 mL 95%的乙醇，黑暗浸提48 h，直至葉片完全變白為準［13］。

1.2.5.3 抗氧化酶活性的測定 采用愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性［14］，采用NBT還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性［15］，利用 Aebi［16］的方法測定過氧化氫酶（CAT）的活性。

1.2.5.4 丙二醛（MDA）含量的測定 采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定玉米新鮮葉片MDA的含量［17］。

1.2.6 數據分析 利用軟件SPSS 20.0進行數據顯著性分析，利用OriginPro 9.0進行繪圖分析。

2 結果

2.1 植物耐鹽促生菌的生理生化及16S rDNA分子學鑒定

經過鹽濃度為10% LB培養基的篩選，從玉米根際土壤中篩選出一株根際耐鹽促生菌Y1，革蘭氏陽性菌，生理生化特征如表1所示。

表1 嗜根考克氏菌Y1的生理生化實驗結果

篩選的根際耐鹽促生菌的16S rDNA基因的PCR目的條帶大小為1 500 bp左右（圖1）。

圖1 篩選菌株16S rDNA基因PCR擴增結果

對根際耐鹽促生菌的16S rDNA的測序結果進行分析，利用DNAMAN進行拼接后顯示其基因序列為1 360 bp，利用數據庫EzBioCloud中的Identify功能，對基因序列進行同源性檢索，結果顯示測得的基因序列與模式菌株Kocuria rhizophila DSM 11926（T）的16S rDNA序列有100%的相似性，利用MAGA6.0進行系統進化分析，構建出如圖2的系統發育樹，Y1代表篩選的根際耐鹽促生菌，由系統發育樹可知Y1與Kocuria rhizophila DSM 11926（T）同屬于一個分支，并具有100%的同源性，結合形態特征及生理生化實驗，認為篩選的這株根際耐鹽促生菌為嗜根考克氏菌。

圖2 根際耐鹽促生菌的系統發育樹

2.2 根際耐鹽促生菌的溶磷特性

無機磷培養基和有機磷培養基上均出現透明圈，表明根際耐鹽促生菌能夠溶解無機態和有機態的磷，并把兩者從無效態轉變成可供自身或植物所吸收的有效態的磷，從而證明此菌具有溶磷的特性。

2.3 根際耐鹽促生菌對玉米幼苗生長影響

2.3.1 對植株株高、根長的影響 玉米生長情況如圖3-4所示，CB組的玉米植株的長勢明顯比CK組玉米好，而CS組的生長狀況明顯比CK組差，并表現出萎蔫的癥狀，品系2玉米的癥狀更加明顯。而在加鹽情況下，接菌組與未接菌組相比，萎蔫程度前者明顯好于后者。說明接種根際耐鹽促生菌能夠促進玉米植株的生長，同時，能緩解鹽脅迫對玉米生長造成的危害。如圖5和6所示，CB組的兩種品系玉米幼苗株高和根長變化量比CK組顯著增加，分別增加了44.96%和49.45%左右；CBS組的兩種品系玉米的株高和根長也顯著高于CS組，分別增加了1.2倍和1.17倍；與CK組相比，CS組的兩種玉米品系的株高和根長指標顯著下降。綜合分析表明，鹽脅迫下，

圖3 品系1玉米在四種處理方式下的生長情況

圖4 品系2玉米在四種處理方式下的生長情況

玉米幼苗的生長受到抑制，但將Y1菌定殖在玉米根際可以緩解鹽脅迫；在沒有鹽脅迫下，將Y1菌定殖在玉米根際也能促進玉米幼苗生長。

2.3.2 對玉米葉片葉綠素的影響 如圖7所示，CB組兩種品系玉米幼苗的總葉綠素含量比CK組提高了74.44%左右；CBS組的總葉綠素含量比CS組提高了56.24%左右；而與CK組相比，CS組兩種品系玉米幼苗的總葉綠素含量則顯著降低。以上結果表明，在鹽脅迫下，玉米幼苗鮮葉上的葉綠素合成受到抑制，影響幼苗光合作用；定殖Y1菌可以使葉綠素維持在較高的水平，從而降低鹽脅迫對光合作用的影響。在沒有鹽脅迫下，定殖Y1菌可以增加玉米幼苗葉綠素的合成，促進幼苗葉片光合作用。

圖5 不同處理對兩種品系玉米株高變化的影響

圖6 不同處理對兩種品系玉米根長變化的影響

圖7 不同處理方式下玉米葉片總葉綠素含量

2.3.3 對植株抗氧化酶活性的影響 如圖8、9、10所示，CB組兩種品系玉米幼苗葉片的CAT、POD和SOD活性與CK組相比顯著下降，但差異性較小，這表明在沒有鹽脅迫下，定殖Y1菌反而使3種抗氧化酶活性降低。CBS組幼苗葉片的CAT活性顯著大于CS組，品系1和品系2分別提高了1.18倍和0.61倍；而POD和SOD活性卻顯著低于CS組。CS組幼苗葉片的3種酶活都顯著高于CK組，這表明在鹽脅迫下，葉片會提高自身抗氧化酶活性來抵御鹽脅迫。

圖8 不同處理下玉米葉片CAT酶的活性

圖9 不同處理下玉米葉片SOD活性的測定

圖10 不同處理下玉米葉片POD活性的測定

2.3.4 對植株MDA含量的影響 如圖11所示，CB組兩種品系玉米幼苗葉片MDA含量顯著低于CK組，CK組的MDA含量是CB組含量的3.24倍左右，這表明在沒有鹽脅迫下，定殖Y1菌使葉片中MDA含量降低。CBS組幼苗葉片MDA含量顯著低于CS組，CS組MDA含量是CBS組的3.08倍左右。這表明在鹽脅迫下，定殖Y1菌使得葉片中MDA含量降低。與CK組相比，CS組幼苗葉片MDA含量顯著增加，這表明鹽脅迫下會增加葉片MDA含量。

圖11 不同處理下玉米葉片MDA的含量

3 討論

土壤鹽漬化會抑制農作物生長，進而降低農作物產量，是農業面臨的一個重大難題［18］。為了降低高鹽對農作物生長造成的毒害，利用耐鹽促生菌來緩解鹽對農作物的脅迫在近些年已得到發展。本研究以高鹽作為條件，篩選出一株耐鹽菌Y1，經鑒定為嗜根考克氏菌。目前，已知的分離自根際的嗜根考克氏菌的主要功能在于耐鹽、分解有機污染物。Abhilash等［19］從植物根際分離出了嗜根考克氏菌，將其用于分解新型持續性有機污染物林丹，結果顯示在中低濃度的林丹土壤中，嗜根考克氏菌能夠分解林丹。全基因組測序表明，嗜根考克氏菌DNA中存在過氧化氫酶、烷基氫過氧化物還原酶，DyP型過氧化物酶和超氧化物歧化酶等多種抗氧化酶基因以及與植物相關的III型PKS基因［20-21］，植物III型聚酮合成酶在植物次生代謝產物生物合成中起著非常重要的作用［22］，因此這可以作為嗜根考克氏菌能作為根際促生菌的可能證據之一。同時本研究驗證嗜根考克氏菌具有高效溶磷的特性，這進一步證實了此菌具有促進植物生長的可能。

研究表明，從不同脅迫環境中分離的根際菌對不同脅迫均具有耐受性，同時也具有促生作用，將這些根際菌定殖在植物根際可以增加植物的根長、株高、生物量、葉綠素含量、類胡蘿卜素含量以及可溶性蛋白含量［23］。本實驗中，CBS組的株高和根長變化量和葉綠素都顯著高于CS組，這進一步證實了Tiwari等的研究。但是CBS組上述指標顯著低于CB組，這表明在鹽脅迫下，耐鹽根際促生菌雖未完全解除鹽對玉米生長的影響，但是在一定程度上緩解了鹽對玉米植株生長帶來的抑制作用。趙清［24］認為當植物受到鹽脅迫時，體內的抗氧化酶活性顯著增強，進而提高植物的抗氧代謝水平，降低因鹽脅迫帶來的植物細胞器功能的損傷。本實驗中，CS組幼苗葉片的3種抗氧化酶活性比CK組顯著增高，這與趙清的研究結果一致。雖然CS組幼苗葉片中的葉綠素含量較CK組有顯著的降低，這可能是由于抗氧化酶并沒有完全清除鹽脅迫帶來的損害，對幼苗葉片葉綠體造成一定的損傷。CBS組中POD和SOD活性卻比CS組顯著降低，這與潘晶等［25］的觀點不一致。這可能是由于植物在受到鹽脅迫后除了激活抗氧化系統，還可以通過非酶促系統如植物自身會產生為類胡蘿卜素、抗壞血酸、谷胱甘肽、類黃酮、生育酚等物質來調節滲透壓抵御鹽脅迫［26］。無論是否有鹽脅迫，在玉米幼苗根際定殖Y1菌都會降低玉米葉片MDA含量，這表明Y1菌可以通過降低葉片MDA含量來減緩鹽脅迫的毒害。綜上所述，嗜根考克氏菌可以作為根際促生菌促進植物生長，這對提高農作物產量具有重要意義。

4 結論

在高鹽條件下，從玉米根際土壤中分離出的Y1菌，經生理生化和16S rDNA分子生物學鑒定為嗜根考克氏菌，該菌具有溶磷特性。利用該菌進行盆栽實驗，用不同方式處理玉米幼苗，15 d后測定玉米幼苗生長生理指標。經測定得出，在沒有鹽脅迫下，將嗜根考克氏菌定殖在玉米幼苗根際上，該菌可以通過提高葉片中葉綠素含量以及降低葉片中的MDA含量來增加株高和根長的變化量，從而促進玉米幼苗的生長；在鹽脅迫下，該菌可以通過提高葉片中葉綠素含量、CAT活性以及降低葉片中的MDA含量來增加株高和根長的變化量，從而緩解鹽對玉米幼苗生長的抑制，促進玉米幼苗的生長。