全基因組小麥PPR基因家族鑒定及表達分析

郭彩娟 公杰 劉永杰 趙昌平 高世慶 吳華偉

（1. 長江大學生命科學學院，荊州 434025；2. 北京雜交小麥工程技術研究中心，北京 100097）

小麥是我國重要的糧食作物之一，雜種優(yōu)勢利用是提高小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的主要途徑，而我國雜交育種的主要途徑是化殺法、二系法和三系法［1-2］。光溫敏雄性不育系是二系雜交小麥的核心種質(zhì)材料，其育性受外界光照條件和溫度調(diào)控［3］。在低溫短日照條件下，不育系的不育度達到99%以上，可用于雜交種的種子生產(chǎn)；在高溫長日照條件下，不育系又表現(xiàn)為雄性可育，自交結(jié)實率達到80%左右從而實現(xiàn)自我繁殖［4-5］。當前對于不育系小麥的育性轉(zhuǎn)換條件、育性遺傳規(guī)律、不育系花粉形態(tài)及基因定位等已有研究［6］，然而對雜交種育性恢復相關基因的研究相對滯后。挖掘一些對小麥雜交種具有育性恢復功能的基因，對于提高雜交小麥的制種產(chǎn)量具有重要意義。

PPR（Pentatricopeptide repeats）蛋白由2-30個串聯(lián)重復的PPR基序組成，每個基序含有35個氨基酸殘基［7-8］。由35個簡并氨基酸組成的基序稱為PPR基序，簡稱P基序。PPR長基序（L-motif）含有35或36個氨基酸殘基，PPR短基序（S-motif）含有31個氨基酸殘基。大多數(shù)PPR蛋白定位于線粒體或者葉綠體［9-10］，也有少量定位于細胞核。研究表明，PPR家族編碼的蛋白能夠參與細胞質(zhì)雄性不育系的育性恢復［11-12］，該家族基因的沉默可能引起胚胎致死［13］。當前，作物中所鑒定的大多數(shù)育性恢復基因為PPR基因家族成員，如Koizuka等［14］發(fā)現(xiàn)Rfk1能夠降低CMS相關轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物ORF125；水稻Rf-1加工線粒體基因atp6恢復育性［15］；水稻RF5與GRP162形成復合體，加工atp6-orf79恢復紅蓮型細胞質(zhì)雄性不育［16］；水稻RF6與OsHXK6互作共同加工atp6-orf79［17］等。然而在小麥中與育性恢復相關PPR基因的研究鮮見報道。

本研究對小麥PPR基因家族進行了全基因組鑒定，通過比較基因組學篩選了一些育性恢復相關的PPR基因，進一步利用在不育條件下減數(shù)分裂期不同雜交組合的幼穗進行熒光定量規(guī)模化篩選與雜交種育性恢復相關的PPR基因，為二系雜交小麥雜交種的育性恢復提供了重要的候選基因資源，為進一步研究PPR基因?qū)﹄s交種的育性恢復機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 以北京雜交小麥工程技術研究中心提供的光溫敏雄性不育系13S122和2個不同恢復系09Y花117-4、原種場親05-4組成的雜交組合為研究材料。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑購自Ambion公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、實時熒光定量試劑盒ChamQ SYBR qPCR Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，其他生化試劑為進口或國產(chǎn)試劑。

1.2 方法

1.2.1 小麥PPR基因家族鑒定及染色體分布、進化 分 析 從 EnsemblPlants（http：//plants.ensembl.org/index.html）數(shù)據(jù)庫下載小麥和水稻的基因組序列、基因注釋文件和蛋白質(zhì)序列。在Pfam29.0［18］（http：//pfam.xfam.org/）下載PPR基因家族的種子序列（PF01535），使用 BLAST［19］將小麥和水稻的蛋白序列與種子序列進行比對，得到本家族的候選成員。再用pfam_scan基于Pfam數(shù)據(jù)庫的HMM文件進行比對，最終得到小麥及水稻PPR基因家族的成員，將這些成員重新編號。

根據(jù)EnsemblPlants中小麥PPR基因家族成員注釋信息將所有成員定位到不同染色體，使用Inparanoid［20］分析小麥PPR基因家族成員的同源等位基因，再使用Circos［21］基于基因注釋信息對同源關系進行可視化。

1.2.2 小麥PPR基因家族的進化分析 將從EnsemblPlants數(shù) 據(jù) 庫（http：//plants.ensembl.org/index.html/）下載的小麥和水稻PPR基因家族的蛋白序列用MEGA6.0［22］中的MUSCLE進行序列比對，使用默認參數(shù)。基于序列比對結(jié)果，用MEGA6.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建進化樹，Bootstrap值為1 000，Partial deletion 95。

1.2.3 育性恢復相關基因的獲取 從EMBL-EBI（https：//www.ebi.ac.uk/）獲取了7個水稻恢復PPR基因的蛋白序列，然后通過Blast搜索這7個基因在小麥中的高同源基因。

1.2.4 實時熒光定量PCR 參考苑少華等［23］方法，統(tǒng)計不同雜交組合材料的結(jié)實率和結(jié)實小穗率。根據(jù)表型統(tǒng)計結(jié)果，從中選取了1個光溫敏雄性不育系（13S122）和1個低恢復系（09Y花117-4）及1個高恢復系（原種場親05-4）配置雜交組合，并對2個雜交組合在河南南陽，即不育條件下減數(shù)分裂期的小麥幼穗為材料，用鑷子剝離幼穗，液氮中速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Trizol試劑（Ambion，USA）提取小麥小穗總RNA，用南京諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）進行反轉(zhuǎn)錄。以18S核糖體RNA作為內(nèi)參基因（表1），采用南京諾唯贊實時熒光定量試劑盒ChamQ SYBR qPCR Master Mix和實時熒光定量伯樂PCR儀（BioRad）進行實時熒光檢測，反應體系與程序參考ChamQ SYBR qPCR Master Mix說明書，數(shù)據(jù)處理采用相對定量法 2-△△CT法［24］。

2 結(jié)果

2.1 小麥PPR基因家族鑒定及染色體定位與分布

經(jīng)EMBL-EBI確認，PPR基因家族的Pfam ID為PF01535，運用HMMER程序搜索小麥和水稻的蛋白序列，去除冗余，最終分別獲取1 351和495個PPR基因家族成員。將小麥和水稻PPR基因家族成員統(tǒng)一編號為TaRF1-TaRF1351和OsRF1-OsRF495。

根據(jù)EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫中小麥基因組注釋信息，將小麥1 351個PPR基因定位到不同染色體（圖1）。小麥PPR基因在各染色體上均有分布，A、B、D染色體分布為455、446和450個，說明B染色體在進化過程中可能發(fā)生了基因丟失事件。第1-第7染色體分別鑒定了194、219、240、167、193、154和184個成員，第6染色體成員最少，而且發(fā)現(xiàn)第6染色體長度也較小。同時，含有最長染色體的3B染色體分布成員最多，共鑒定到88個基因，而4B染色體含有成員最少，僅包含48個PPR基因，推測該家族成員數(shù)量可能和染色體長度有關，另外可能也與染色體結(jié)構(gòu)的差異有關。

表1 熒光定量PCR引物序列

從共線關系結(jié)果看出小麥PPR基因家族不僅在A、B、D 3個同源染色體間有大量同源基因，而且在A、B、D 3個同源染色體中的2個以上，以及在非同源染色體上也存在大量的同源基因，說明小麥PPR基因家族成員具有高度重復序列，基因重復事件非常復雜。

圖1 小麥PPR基因家族染色體分布與共線關系

2.2 小麥和水稻PPR基因家族進化分析

將鑒定的小麥與水稻PPR基因家族成員蛋白序列基于MEGA6.0的MUSCLE比對，用NJ法構(gòu)建進化樹，利用EvolView對進化樹進行可視化（圖2）。結(jié)合Chen等［25］鑒定的水稻PPR基因家族成員，發(fā)現(xiàn)水稻PPR基因家族的P亞族集中分布于Ⅰ亞族，而水稻的PLS亞族集中分布于Ⅱ亞族。而E1、E2以及PLS亞族在Ⅱ亞族中分布較為分散，說明PPR基因家族蛋白序列構(gòu)成較為復雜。小麥PPR家族共有760個成員與水稻的P亞族聚在一起，587個成員與PLS亞族聚在一起，有4個成員未與水稻PPR基因聚在一起。

2.3 小麥PPR基因家族育性恢復基因候選和表達分析

圖2 小麥與水稻PPR基因家族系統(tǒng)進化樹

2.3.1 育性恢復相關基因的獲取 從EMBL網(wǎng)站尋找水稻已鑒定的具有育性恢復功能的PPR基因，在EnsemblPlants網(wǎng)站搜索與小麥高同源的基因，將搜索到的高同源基因與水稻的育性恢復基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3）。發(fā)現(xiàn)水稻中具有育性恢復功能的7個基因間進化關系較近，猜測PPR基因家族在不同物種間分化程度較高。通過DNAMAN進行比對，發(fā)現(xiàn)候選基因中與水稻育性恢復基因同源性達到40%以上有7個，TaRF723和TaRF1168與水稻Rf-1A的同源性分別為45.58%和50.13%，TaRF35和TaRF1104與Rf-1B的同源性分別為44.35%和44.64%，TaRF118與Rf-4like的同源性為42.38%，TaRF1270和TaRF1164與PPR794的同源性分別為44.57%和44.08%。

2.3.2 不同雜交組合結(jié)實率統(tǒng)計分析 采用國際法結(jié)實率統(tǒng)計不同雜交組合材料的穗粒數(shù)、結(jié)實小穗數(shù)、總小穗數(shù)等［國際法結(jié)實率=穗粒數(shù)/（2×總小穗數(shù)］×100%和結(jié)實小穗率=（結(jié)實小穗數(shù)/總小穗數(shù)）×100%）。結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，13S122與09Y花117-4雜交后，F(xiàn)1結(jié)實率、結(jié)實小穗率、穗粒數(shù)分別為73.37%、72.57%和25.67%，均比父本09Y花117-4低，確定09Y花117-4為低恢復系。而13S122與原種場親05-4雜交后，F(xiàn)1結(jié)實率和穗粒數(shù)分別為127.78%和49.33%，而原種場親05-4結(jié)實率和結(jié)實小穗率分別為98.55%和36.33，F(xiàn)1遠遠大于父本材料原種場親05-4，結(jié)實小穗率略低于父本，認定原種場親05-4為高恢復系。

圖3 小麥、水稻PPR同源基因進化樹

2.3.3 育性恢復PPR基因的表達模式分析 為了篩選鑒定育性恢復基因，從大量雜交組合中挑選了一個高恢復組合和一個低恢復組合，對與水稻育性恢復高度同源的23個小麥PPR基因進行熒光定量表達篩選。結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，在高恢復系組合中，TaRF124、TaRF752、TaRF1164和TaRF1347表現(xiàn)出明顯的超親表達，差異倍數(shù)達到2倍以上。而TaRF70、TaRF173、TaRF174、TaRF752、TaRF-1094、TaRF1106和TaRF1168的表達量僅有微弱的超親表現(xiàn)。同時，這些基因在低恢復系組合中除了TaRF1168有微弱的超親表達外，其他PPR基因在F1的表達量基本處于低親水平，這些PPR基因的表達與其雜交種的結(jié)實率表型具有高度的一致性（圖5）。因此，推測TaRF124、TaRF752、TaRF1164、TaRF1347可能對雜交種結(jié)實率起到育性恢復作用。

圖4 23個候選基因在高恢復度雜交組合中的表達分析

圖5 23個候選基因在低恢復度雜交組合中的表達分析

3 討論

隨著不同物種基因組測序的完成，PPR基因家族成員鑒定也有了很大進展。目前，除了模式植物擬南芥［1］、水稻［25］、番茄［26］和煙草［27］，甘藍型油菜［28］、棉花［29］、谷子［30］等物種的 PPR 基因家族也已被鑒定，對各物種中一些PPR基因也進行了相關研究。研究發(fā)現(xiàn)，PPR基因能夠參與線粒體和葉綠體基因轉(zhuǎn)錄后加工、調(diào)控雄性不育相關基因的表達、參與胚胎形成、參與逆境防御等。本研究運用生物信息學方法對小麥全基因組進行搜索，鑒定了1 351個PPR基因，與所有已鑒定PPR基因家族成員的其他物種相比，小麥含有最多的PPR基因家族成員，這可能與小麥的龐大基因組有關。另外，與Chen等［25］鑒定的水稻PPR基因家族的染色體分布信息進行對比后，發(fā)現(xiàn)二者雖均分布于該物種所有染色體上，但是水稻PPR基因家族在染色體上分布相對集中，而小麥PPR基因家族成員則分布相對分散，推測小麥PPR基因家族成員的功能可能具有多樣性和復雜性。

此外，本研究結(jié)合了二系雜交小麥的農(nóng)藝性狀，不僅在不育系與可育系之間做了表達分析，而且，在二者雜交后的子一代也做了表達分析，能充分反應PPR基因?qū)﹄s交種的育性恢復是否起到作用。有趣的是，在高恢復系雜交組合中，候選基因在不育系中表達水平都比恢復系表達水平高，在低恢復系雜交組合中，TaRF70和TaRF1106在不育系表達水平比恢復系表達水平低，而其他候選基因同樣是不育系表達水平比恢復系表達水平高，這與Liu等［31］在甘藍型油菜中鑒定的育性恢復基因Rfn在不育系181A和恢復系H5中表達模式相似，這種差異表達模式有待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)TaRF124、TaRF752、TaRF1164、TaRF1347在高恢復系雜交組合中有明顯的超親表達，而在低恢復系雜交組合中呈現(xiàn)了低親的表達模式，推測這些基因可能參與調(diào)控雜交種的育性恢復，但還需要通過基因編輯技術來深入研究候選PPR基因的功能。

4 結(jié)論

從小麥最新基因組數(shù)據(jù)中鑒定出1 351個PPR基因，候選出了與水稻高度同源的23個小麥PPR基因，并初步篩選了4個育性恢復相關PPR基因。