多烯磷脂酰膽堿逆轉(zhuǎn)胺碘酮與決奈達(dá)隆誘發(fā)肝功能異常的實(shí)驗(yàn)研究

趙圣剛 許建江 張祥宇 張冉 江力勤

胺碘酮是臨床常用的Ⅲ類抗心律失常藥物,但該藥可造成器官組織損傷[1-3]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用胺碘酮人群中無(wú)癥狀肝酶升高發(fā)生率達(dá)到25%[4-6]。決奈達(dá)隆作為胺碘酮的替代藥品，在胺碘酮分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上去除碘，減少高碘導(dǎo)致的不良反應(yīng)，但近期出現(xiàn)決奈達(dá)隆導(dǎo)致急性肝功能障礙甚至衰竭的報(bào)道[7-8]。由于前述動(dòng)物試驗(yàn)研究時(shí)間偏短，不能揭示達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度后劑量及累計(jì)劑量與肝毒性的關(guān)系以及毒副反應(yīng)的時(shí)效關(guān)系，且未分析保護(hù)性藥物是否產(chǎn)生作用。所以本實(shí)驗(yàn)探討長(zhǎng)周期胺碘酮和決奈達(dá)隆對(duì)肝功能的影響，鑒定多烯磷脂酰膽堿的保護(hù)作用，評(píng)價(jià)決奈達(dá)隆的安全性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 取雄性SD大鼠50只，清潔級(jí)，體重180～220g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)[合格證：SCXK（浙）2008-0033號(hào)] 。經(jīng)常規(guī)飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為胺碘酮（AM）組、決奈達(dá)?。―R）組、胺碘酮+多烯磷脂酰膽堿（AC）組、決奈達(dá)隆+多烯磷脂酰膽堿（DC）組及對(duì)照組，每組10只。根據(jù)人和動(dòng)物間體表面積折算系數(shù)計(jì)算等效劑量和課題組前期試驗(yàn)確定，胺碘酮和決奈達(dá)隆藥物劑量均為120mg·kg-1·d-1，多烯磷脂酰膽堿劑量為200mg·kg-1·d-1。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件：SPF級(jí)大鼠飼養(yǎng)室、SPF級(jí)大鼠實(shí)驗(yàn)室，溫度（22±2）℃，濕度 50%～70%，光照：150～200Lx，12h 明暗交替，噪音＜50dB，屏障系統(tǒng)溫度、濕度、光照、壓力梯度等設(shè)有自動(dòng)控制和顯示系統(tǒng)，每籠5只飼養(yǎng)于不銹鋼籠具中。采取不同濃度等容積灌胃給藥，給藥體積為2ml/100g，每天上午給藥1次，對(duì)照組喂等量的自來(lái)水，連續(xù)13周。

1.2 藥物及試劑儀器 胺碘酮由賽諾菲安萬(wàn)特（杭州）制藥有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：175）；決奈達(dá)隆由賽諾菲安萬(wàn)特制藥有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：HK-59499）；生化測(cè)定用試劑盒均為寧波市慈城生化試劑廠產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 一般狀態(tài)觀察 每天上午給藥時(shí)觀察大鼠的活動(dòng)、呼吸、毛色和大便等狀態(tài)，每周稱量體重1次，根據(jù)新的體重調(diào)整給藥體積。

1.3.2 臟器重量及臟器系數(shù) 喂養(yǎng)至第13周，7%水合氯醛1ml/100g腹腔注射，麻醉后，分離肝臟，計(jì)算臟器系數(shù)[（臟器重量/體重）×100%] 。

1.3.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 分別于給藥后第4、8、12周末尾靜脈取血，喂養(yǎng)至13周末，用7%水合氯醛1ml/100g腹腔注射,麻醉后均股動(dòng)脈取血。按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、總蛋白（TP）。

1.3.4 病理學(xué)檢查 上述臟器用4%甲醛固定，石臘包埋切片，常規(guī)HE染色后鏡檢，典型病變采用Motic生物顯微圖像采集分析系統(tǒng)攝影。取部分典型樣本1%鋨酸4℃固定，常規(guī)電鏡樣品制備程序脫水、滲透，Epon812包埋后超薄切片，常規(guī)染色，H-600A型透射電鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，方差齊性多組間兩兩比較采LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊經(jīng)Welch矯正后采用DunnettT3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠一般狀態(tài) 4個(gè)給藥組大鼠給藥初期出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，行動(dòng)遲緩，個(gè)別大鼠出現(xiàn)稀便。在第1～3周，4個(gè)給藥組大鼠體重均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；見(jiàn)表1。

2.2 5組大鼠臟器重量和臟器系數(shù)比較 見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，5組大鼠肝臟重量相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；AM、AC組肝臟系數(shù)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

2.3 5組大鼠肝酶水平比較 見(jiàn)表2～5。

由表2可見(jiàn)，第4周AC和DR組均低于對(duì)照組（均P＜0.05）；第8周AM和DR組AST水平高于對(duì)照組，AC和DC組AST水平分別低于AM和DR組（P＜0.05或0.01）；第12周，4個(gè)給藥組AST水平均高于對(duì)照組（P＜0.05或0.01）；但13周與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。由表3可見(jiàn)，第8周AC和DR組ALT水平高于NC組（均P＜0.05），第12周DR組ALT水平高于其他組（P＜0.05或0.01），AC及DC組ALT水平分別低于AM和DR組，其中DC與DR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)AM與AC組比較、DR與DC組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。由表4、5 可見(jiàn)，AM 和 AC 組 AKP 水平第 4、12、13 周均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01），DR、DC 組第 8、13周低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。4個(gè)給藥組與對(duì)照組比較在第8周和第12周TP水平降低，其中AM、DR、DC組在第8周，AC組在第12周與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

圖1 5組大鼠肝臟重量及肝臟系數(shù)比較（注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與AM組比較，△P＜0.05）

表2 5組大鼠AST水平比較（U/L）

2.4 AM組、DR組及對(duì)照組肝臟組織電鏡檢查結(jié)果 見(jiàn)插頁(yè)圖2。

由圖2可見(jiàn)，AM組肝臟細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)模糊（AM-1、AM-2）板層體空泡（AM-3）線粒體及板層體空泡（AM-4）。DR組肝臟細(xì)胞空泡增多（DR-1）線粒體嵴模糊或者消失（DR-2、DR-3）。

圖2 大鼠肝臟電鏡圖片（NC：對(duì)照組；AM：胺碘酮組；DR：決奈達(dá)隆組，×5 000）

3 討論

心律失常抑制試驗(yàn)結(jié)果的發(fā)表，使傳統(tǒng)藥物治療觀念發(fā)生了明顯改變，Ⅰ類藥物在抗心律失常治療中的地位逐漸下降。胺碘酮是廣譜的抗心律失常藥物，具有低致心律失常和弱負(fù)性肌力作用，并且適用于有器質(zhì)性心臟病患者，使其在抗心律失常治療中的地位備受重視[1-3]。決奈達(dá)隆為胺碘酮的去碘衍生物，其在胺碘酮分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上去除碘原子，加上硫胺甲烷基團(tuán)，降低了脂溶性，降低了組織堆積效應(yīng)和半衰期，可以降低高碘效應(yīng)導(dǎo)致的毒副反應(yīng)[1-3]。

表3 5組大鼠ALT水平比較（U/L）

表4 5組大鼠TP水平比較（g/L）

表5 5組大鼠AKP水平比較（U/L）

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用胺碘酮人群中無(wú)癥狀肝酶升高發(fā)生率達(dá)到25%，引起嚴(yán)重肝損傷的占1%～3%[4-6]。肝毒性出現(xiàn)與血漿中胺碘酮及其代謝物質(zhì)去乙基胺碘酮（DEA）血藥濃度和累計(jì)劑量有關(guān)，但其他研究認(rèn)為胺碘酮應(yīng)用療程和累計(jì)劑量與肝毒性出現(xiàn)無(wú)關(guān)，低劑量胺碘酮肝損傷發(fā)生率無(wú)明顯下降[4-6]。目前認(rèn)為胺碘酮肝毒性機(jī)制涉及胺碘酮導(dǎo)致直接損傷，機(jī)體特異質(zhì)反應(yīng)，原發(fā)疾病和藥物代謝干擾等。胺碘酮影響脂肪酸β氧化、氧化磷酸化解耦聯(lián)、氧化應(yīng)激、磷脂細(xì)胞膜流動(dòng)和過(guò)氧化物酶增值物激活受體α（PPARα）等導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[9-13]。Athena研究認(rèn)為2 291例決奈達(dá)隆服用者中有12例出現(xiàn)肝功能障礙[14]，但在Euridis/Adonis研究中發(fā)生率達(dá)到12%[15]。2011年FDA發(fā)布決奈達(dá)隆可導(dǎo)致嚴(yán)重肝臟損傷的消息，但對(duì)于肝功能障礙的機(jī)制尚不明確[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)考慮到胺碘酮半衰期較長(zhǎng)，為求達(dá)到胺碘酮穩(wěn)態(tài)血藥濃度，特設(shè)定研究周期為13周，長(zhǎng)于目前其他相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從而更能揭示胺碘酮及決奈達(dá)隆肝損傷的藥物依賴及時(shí)間依賴性。本實(shí)驗(yàn)得出給藥組大鼠前期活動(dòng)緩慢、稀便等與胺碘酮和決奈達(dá)隆導(dǎo)致胃腸道反應(yīng)有關(guān)，體重生長(zhǎng)變慢考慮與胺碘酮及其代謝產(chǎn)物DEA、決奈達(dá)隆競(jìng)爭(zhēng)性抑制甲狀腺受體α1，導(dǎo)致食欲減退[11-13，16]。胺碘酮同時(shí)可導(dǎo)致肝臟重量及肝臟系數(shù)增加，提示存在藥物毒性，考慮與PPARα活性升高有關(guān)[13]。胺碘酮和決奈達(dá)隆于第8、12周導(dǎo)致輕度ALT、AST水平升高，多烯磷脂酰膽堿能拮抗肝功能受損情況，與我們之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同[3]，胺碘酮和決奈達(dá)隆對(duì)AKP影響，提示分泌障礙受損，這可能由于胺碘酮和決奈達(dá)隆為多通道阻滯劑，抑制K+通道，引起膽道平滑收縮障礙，導(dǎo)致膽汁分泌障礙，引起AKP升高[17]。至于胺碘酮是否導(dǎo)致膽道系統(tǒng)纖維化，進(jìn)而引起狹窄尚不明確。肝臟電鏡檢查提示胺碘酮與決奈達(dá)隆均可導(dǎo)致細(xì)胞呈空泡，線粒體結(jié)構(gòu)改變，這與之前胺碘酮導(dǎo)致病理變化相同，可能與胺碘酮可引起線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)、電子轉(zhuǎn)移鏈障礙，自由基生成增多等，導(dǎo)致線粒體損傷，引起細(xì)胞供氧障礙，引發(fā)細(xì)胞壞死和凋亡，由于決奈達(dá)隆與胺碘酮分子結(jié)構(gòu)相同，推測(cè)可能由于分子結(jié)構(gòu)中某些基團(tuán)導(dǎo)致肝毒性的出現(xiàn)。

總之，本研究得出多烯磷脂酰膽堿能拮抗胺碘酮和決奈達(dá)隆引起的肝功能異常，但對(duì)其機(jī)制需待下一步研究證實(shí)。