室旁核IL-1β介導CRH神經元敏化參與大鼠慢性內臟痛

陳自洋 饒竹青 孫曉迪 李競進

（南京醫科大學第一附屬醫院麻醉科，南京 210009）

慢性內臟痛是多因素導致的高發性和頑固性疾病，嚴重影響患病人的生活質量且耗費大量醫療資源[1]。由于引起慢性內臟痛的確切分子生物學機制尚不清楚，目前臨床仍缺乏有效的藥物治療。下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)是聯系腦和腸道的關鍵軸，參與腸道功能調控，HPA軸功能亢進可導致慢性內臟痛病人內臟高敏[2]。促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotrophin-releasing hormone, CRH)是HPA軸最高級中樞下丘腦室旁核(paraventricular nucleus, PVN)分泌的重要應激激素，且參與慢性內臟痛調控[3,4]。研究顯示，PVN內CRH神經元敏化介導了慢性內臟痛的發生與發展，但觸發PVN內CRH神經元敏化的上游分子機制仍不明確。IL-1β是重要的促炎性細胞因子，在慢性疼痛的產生與維持過程中發揮重要作用，其主要通過增加神經元的興奮性導致中樞敏化[5～7]。本文主要目的是首先觀察PVN內IL-1β在慢性內臟痛中的作用，探討PVN內IL-1β是否敏化CRH神經元，從而參與慢性內臟痛的調節，進而明確IL-1β是CRH神經元敏化的上游分子，為臨床慢性內臟痛的防治提供新靶點及理論依據。

方 法

1.動物選擇及分組

本研究獲南京醫科大學實驗動物中心倫理委員會批準。清潔級健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠32只，8日齡，采用隨機數字表法分為4組(n= 8)：假手術+ PBS組（Sham + PBS組）、假手術 + IL-1β抑制劑組（Sham + Gevokizumab組）、模型+ PBS組（CRD + PBS組）、模型+ IL-1β抑制劑組（CRD + Gevokizumab組）。同窩子鼠平均分入各組，Sham組大鼠不進行結直腸擴張，CRD組制備大鼠慢性內臟痛模型；出生后第8周，通過立體定位法室旁核微量注射0.5 μl的IL-1β抑制劑Gevokizumab 5 μg或PBS，2 h后測定內臟痛閾值；所有新生大鼠均與母鼠同籠直到第28 d，鼠乳喂養。母嬰分離后，每4只子鼠1籠，保持室溫23±1℃及12 h/12 h明暗光照，自由進食和進水。于出生后第8周評估大鼠內臟痛行為。

2.主要試劑和儀器

小鼠抗大鼠CRH（100 μg，35748，Abcam公司，美國），Alexa 488 驢抗鼠 IgG （500 μl，A21202，Life Technologies公司，美國），兔抗大鼠c-Fos（100 μl，190289，Abcam公司，美國），Alexa594驢抗兔IgG（500 μl，A21207，Life Technologies公司，美國），IL-1β抑制劑Gevokizumab（052，XOMA公司，美國），熒光顯微鏡（Olympus IX-81，日本），鼠腦立體定位儀（瑞沃德，深圳）。

3.慢性內臟痛模型制備

參照文獻[8]，通過對新生期大鼠反復結直腸擴張(colorectal distension, CRD)制備慢性內臟痛模型。新生大鼠于出生后第8、10、12 d，每天上午固定時間給予兩次結直腸擴張，兩次時間間隔30 min。結直腸擴張是將直徑3 mm，長20 mm的血管成形術導管從肛門插入至清醒新生大鼠的降結腸，用0.3 ml水擴張產生60 mmHg的壓力在結腸內留置1 min后，將其減壓退出。Sham組大鼠除未進行結直腸擴張外，其它操作均與CRD組相同。

4.PVN內微量注射

各組大鼠飼養到第8周，體重200～250 g，七氟醚麻醉后，取仰臥位固定，備皮，碘伏消毒，固定于腦立體定位儀上，沿正中線切開頭皮，骨膜，在相應位置用手術刀片縱行切開一個長切口，雙氧水脫去骨膜，通過立體定位儀定位，亞甲藍標記后用消毒過的微型鉆頭鉆孔，術野滴少量人工腦脊液以防干燥。通過立體定位儀分別將載有IL-1β抑制劑Gevokizumab或 PBS 0.5 μl的微量注射器針尖緩慢（約1 min）插至下丘腦PVN (AP -1.6 mm,R ± 0.4 mm, H -7.8 mm)，緩慢（約3 min）注射藥物，留針10 min后緩慢（約1 min）拔出針尖。骨蠟封閉鉆孔，縫合傷口，并用抗生素處理。

5.痛閾測定

大鼠出生后第8周，PVN內給藥后2 h時，七氟醚麻醉后，將未充氣的球囊涂石蠟油后插入結直腸內，將大鼠放置在20 cm×6 cm×8 cm的玻璃箱內觀察，約15 min大鼠完全適應后開始實驗。壓力擴張范圍10 mmHg～80 mmHg，每次擴張壓力重復3次，取平均值，通過注射器持續、勻速緩慢加壓，每10 mmHg為一壓力梯度，每個壓力停留10 s，間隔4 min，以肉眼觀察出現明顯的下腹壁抬離箱底或明顯收縮變平時的最小壓力為痛閾。

6.免疫熒光染色檢測

內臟痛行為學測試結束后，七氟醚麻醉大鼠，迅速開胸暴露心臟經升主動脈插管，依次灌注0.9%生理鹽水200 ml及4%多聚甲醛300 ml，大鼠灌注后取腦，多聚甲醛后固定于4 ℃ 過夜，然后放入30%蔗糖中脫水。腦組織冠狀冰凍連續切片（厚度30 μm），貼片室溫晾干后 PBS 漂洗，用含有0.3%Triton X-100的10%驢血清室溫封閉2 h，加入兔抗大鼠c-Fos抗體以及小鼠抗大鼠CRH抗體，4℃孵育過夜后，PBS漂洗10 min×3 遍，暗室內加入Alexa 594驢抗兔IgG和Alexa 488驢抗鼠IgG，二抗室溫孵育2 h，PBS漂洗10 min×5遍，室溫避光晾干后，無水甘油封片，IX-81共聚焦顯微鏡下觀察拍片、計數。

7.統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，正態分布的計量資料以均數±標準差(±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1.PVN內微量注射IL-1β抑制劑Gevokizumab對大鼠內臟痛行為的影響

與Sham + PBS組(59.1±4.2)、Sham + Gevokizumab組(55.9±3.8)相比，CRD + PBS組(38.3±3.1)大鼠痛閾值明顯降低（P＜ 0.05，見圖1）；CRD +Gevokizumab組(46.2±4.3)較CRD + PBS組大鼠痛閾值明顯增加（P＜ 0.05，見圖1）。表明PVN內IL-1β參與了大鼠慢性內臟痛的調節。

圖1 各組大鼠痛閾值比較(n = 8,±SD)*P ＜ 0.05，與 Sham + PBS 組、Sham + Gevokizumab組相比；#P ＜ 0.05，與CRD + PBS組相比Fig.1 Comparison of pain thresholds in rats of different groups (n = 8,±SD)*P ＜ 0.05, compared with Sham + PBS group and Sham + Gevokizumab group; #P ＜ 0.05, compared with CRD + PBS group.

2.PVN內微量注射IL-1β抑制劑Gevokizumab對c-Fos表達的影響

c-Fos是神經元活化的標志物，免疫熒光結果 顯 示， 與 Sham + PBS組 (61.2±8.1)、Sham +Gevokizumab組 (60.5±5.3)相 比，CRD + PBS組(101.3±8.9)大鼠PVN內c-Fos表達明顯增加（P＜0.05，見圖2）；CRD + Gevokizumab (80.8±4.8)組較CRD + PBS組大鼠c-Fos表達明顯降低（P＜ 0.05，見圖2）。表明PVN內IL-1β介導神經元敏化參與了大鼠慢性內臟痛的調節。

3.PVN內微量注射IL-1β抑制劑Gevokizumab對CRH神經元敏化的影響

免疫熒光結果顯示，與Sham + PBS組(26.5±3.3)、Sham + Gevokizumab 組 (23.8±4.0)相比，CRD + PBS組 (58.2±6.5)大 鼠 PVN內 CRH與c-Fos共標比例明顯增加（P＜ 0.05，見圖3）；CRD + Gevokizumab組 (42.1±3.4)較 CRD + PBS組大鼠CRH與c-Fos共標比例明顯降低（P＜ 0.05，見圖3）。表明PVN內IL-1β介導CRH神經元敏化參與了大鼠慢性內臟痛的調節。

討 論

隨著人們對高質量生活的追求，內臟性疼痛被更多的人們所重視。早期不良生活經歷是導致成年后慢性內臟痛的重要因素，尤其是新生期，為傷害性感覺神經回路發育的關鍵時期，此時的傷害性刺激可以導致新生個體神經傳入通路永久性的改變[9]。臨床研究發現，慢性內臟痛病人與健康對照受試者相比，多有童年期不良生活應激的經歷[10]。動物實驗也顯示，大鼠新生期CRD可導致其成年后慢性內臟高敏，是慢性內臟高敏的常用動物模型[11]。

大腦與遠離它的腸道有豐富的網絡聯系，其中HPA軸是聯系腦和腸道的關鍵環節， HPA軸持續亢進，可導致外周腸道釋放多種促炎介質，激活內臟痛覺傳導通路，從而引起慢性內臟痛[2]。HPA軸的最高級中樞位于PVN，既往研究顯示PVN區是調控疼痛的關鍵腦區，在神經病理性疼痛、炎性疼痛中發揮重要作用[12,13]。最近研究發現，PVN區也參與了慢性內臟痛的調控[7]。目前大量研究證實，PVN內CRH神經元敏化是慢性內臟痛發病的重要機制[3,4,7]，但介導CRH神經元敏化的上游分子機制尚不明確。

促炎細胞因子可以增強其周圍神經元的興奮性，產生興奮后突觸后電位，導致慢性疼痛的產生與維持[5]。其中IL-1β是一種典型的多功能促炎細胞因子，是引起炎癥及免疫反應的關鍵因子之一，在內臟痛、神經病理性疼痛、炎性痛等慢性疼痛中發揮重要作用[11,14]。研究報道，慢性內臟痛大鼠

PVN內IL-1β表達明顯增加[7]；本研究進一步發現，PVN內微量注射IL-1β抑制劑Gevokizumab可緩解慢性內臟痛大鼠的內臟高敏。表明，PVN內IL-1β參與了大鼠慢性內臟痛的調控。然而， PVN內IL-1β是否通過介導CRH神經元敏化參與大鼠慢性內臟痛的調節仍不明確。

圖2 各組大鼠c-Fos的表達數量(n = 4,±SD)*P ＜ 0.05，與Sham + PBS組、Sham + Gevokizumab組相比；#P ＜ 0.05，與CRD + PBS組相比Fig.2 Comparison of the number of c-Fos expression between different groups (n = 4,±SD)Representative images of immuno fl uorescence labeling for c-Fos (Red) in PVN (outlined by white dashed lines).A: Sham + PBS group; B: Sham + Gevokizumab group; C: CRD + PBS group; D: CRD + Gevokizumab group; E:quantitative analysis of c-Fos expression in PVN. *P ＜ 0.05, compared with Sham + PBS group and Sham + Gevokizumab group; #P ＜ 0.05, compared with CRD + PBS group.

圖3 各組大鼠CRH神經元的活化率(n = 4,±SD)*P ＜ 0.05，與Sham + PBS組、Sham + Gevokizumab組相比；#P ＜ 0.05，與CRD + PBS組相比Fig.3 Comparison of the activation rate of CRH neurons between different groups (n = 4,±SD)Representative images of immuno fl uorescence labeling for CRH (Green) and c-fos (Red) in PVN (outlined by white dashed lines). A: Sham + PBS group; B: Sham + Gevokizumab group; C: CRD + PBS group; D: CRD + Gevokizumab group; E:quantitative analysis of the activation rate of CRH neurons in PVN. *P ＜ 0.05, compared with Sham + PBS group and Sham + Gevokizumab group; #P ＜ 0.05, compared with CRD + PBS group.

本研究檢測了c-Fos，作為即刻早期基因，其是神經元活化的標志物，可介導神經信號的一系列反應，在一些刺激所致的大腦區域被明顯激活[15]。本研究結果顯示，慢性內臟痛大鼠PVN內c-Fos表達較對照組明顯增加；PVN內微量注射IL-1β抑制劑Gevokizumab可降低慢性內臟痛大鼠c-Fos表達的數量，提示PVN內IL-1β可導致神經元興奮性增加，從而參與大鼠慢性內臟痛調節。我們進一步明確是否PVN內IL-1β介導了CRH神經元的興奮性增加。結果顯示，慢性內臟痛大鼠PVN內CRH神經元與c-Fos共標的比例明顯增加；PVN內微量注射IL-1β抑制劑Gevokizumab可降低慢性內臟痛大鼠CRH神經元與c-Fos共標的比例，表明PVN內IL-1β介導了CRH神經元敏化。基于上述實驗，我們認為PVN內IL-1β介導了CRH神經元敏化，進而參與了大鼠慢性內臟痛的發生與發展。既往研究發現，PVN內不存在IL-1β受體，其可能通過間接作用促進了CRH神經元敏化[16]，其確切機制需進一步研究。

綜上所述，PVN內IL-1β介導了CRH神經元敏化，進而參與大鼠慢性內臟痛的調節。本研究對進一步認識慢性內臟痛的病理生理機制，以及對臨床上慢性內臟痛病人針對IL-1β這一潛在靶點進行干預從而緩解其內臟高敏具有重要的意義。然而，本實驗只是從形態學方面觀察了CRH神經元活化的特性，進一步的研究將應用電生理記錄CRH神經元的放電頻率，從而證實IL-1β與CRH神經元的相關性。