利塞膦酸鈉對神經病理性疼痛大鼠模型的抗炎鎮痛作用*

卜慧蓮 連一聞 許繼田 馬民玉△

（1鄭州大學第一附屬醫院疼痛科，鄭州450052；2鄭州大學基礎醫學院生理教研室，鄭州450052）

神經病理性疼痛[1](neuropathic pain, NP) 是中樞和/或外周感覺神經系統損傷所引起的慢性疼痛綜合征，其典型的癥狀包括自發性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏，該疾病在全球其患病率可高達21.6%，進而越來越被臨床醫生及基礎研究學者重視。在神經損傷后，小膠質細胞釋放大量促炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1β以及IL-6等[2]，由此引起的神經炎癥反應是造成NP的重要原因。關于NP的臨床藥物治療主要包括局部麻醉藥、非甾體類抗炎鎮痛藥、抗癲癇藥及阿片類鎮痛藥物，非甾體類藥物大多具有消化系統副作用，阿片類鎮痛藥主要作用于外周或脊髓背角的阿片類受體，但長期服用后會產生藥物鎮痛耐受，同時引起便秘、疲乏、過度鎮靜等副作用[3]。抗驚厥藥目前廣泛用于神經病理性疼痛的治療，但其對認知功能的損害一直是不可忽視的重點[4]。因此尋找新的藥物治療思路顯得尤為重要。

利塞膦酸鈉 (risedronate, RIS) 是第三代含氮雙膦酸鹽，主要用于骨質疏松癥、骨癌痛及佩吉特病等[5]，最新的《神經病理性疼痛診療指南專輯》中提出，雙膦酸鹽類藥物可用于治療神經病理性疼痛，為B級推薦用藥，但關于RIS是否對NP產生抗炎鎮痛作用未見有報道。研究表明RIS具有抗炎作用，其在炎性痛動物模型中抑制破骨細胞產生促炎癥細胞因子，進而發揮鎮痛作用[6]；而破骨細胞與神經小膠質細胞同屬于單核吞噬細胞系統[7]，同時Rahn等[8]發現雙膦酸鹽的一種阿倫膦酸鈉減弱了腫瘤誘導的外周和中樞致敏標志物，如星形膠質細胞標志物GFAP，因此推測RIS可能會抑制小膠質細胞分泌促炎癥細胞因子來產生鎮痛作用，因此本研究旨在探討RIS對大鼠NP的鎮痛作用及其對脊髓 (spinal cord, SP) 和背根神經節(dorsal root ganglion, DRG) 中炎癥因子表達的影響。

方 法

1.實驗動物

本實驗選取230～250 g成年雄性SD大鼠（河南省鄭州市實驗動物中心），采取分籠飼養，自由攝食飲水，室溫24±2℃，濕度60%～70%，8:00～20:00光照，動物適應環境3 d后開始實驗。進行疼痛行為學檢測的大鼠用隨機數字表法分為6組 (n= 8)：假手術 (Sham + saline) 組、手術 (SNL +saline) 組、RIS低劑量治療 [R (L)]、RIS中劑量治療組[R (M)]、RIS高劑量治療組 [R (H)]及空白對照組 (Control + RIS)；其中RIS劑量分別為0.1、0.5、1 mg/kg，0.1 ml/只，采用皮下注射，假手術 (Sham)組、空白對照(C)組及手術 (SNL) 組注射等體積無菌生理鹽水。根據上步實驗結果，在Elisa檢測中將大鼠隨機分為4組 (n= 6)：手術組 (SNL + saline)，RIS中劑量治療組 [R (M)]假手術組 (Sham + saline) 及空白對照組 (Control + RIS)，分別皮下注射0.5 mg/kg RIS或等體積的生理鹽水。所有動物實驗操作均符合鄭州大學動物保護協會和使用委員會的要求，并且與國家動物保護研究所的指南一致。

2.藥物

利塞膦酸鈉（揚子江藥業批號：16122501），以無菌生理鹽水配置成相應濃度溶液供皮下注射應用。注射時間為術前30 min至術后7 d，持續注射，每只0.1 ml，每天1次。

3.NP模型制備

本實驗依照La Bu Da等[9]的方法采取大鼠左側第5腰椎脊神經結扎模型(spinal nerve ligation,SNL)，利用異氟醚對大鼠進行吸入麻醉，術區備皮，常規消毒皮膚，鋪無菌巾，平髂嵴，雙側髂后上棘連線中點向左旁開0.5 cm做縱行切口，切開皮膚及皮下筋膜，鈍性分離顯露脊椎，切除L5橫突后暴露其下方的L5脊神經，用5-0絲線結扎神經并剪斷，用3-0絲線逐層縫合口，大鼠蘇醒后禁食1 d，自由飲水，術畢送回動物飼養室，假手術(Sham)組僅暴露L5脊神經，不進行結扎剪斷處理。

4.機械性撤足閾值(mechanical withdraw threshold,MWT)的測定

按Tal等[10]的“up-down”方法，選用8根呈對數遞增的Von Frey Hair纖毛 (3.61、3.84、4.08、4.31、4.56、4.74、4.93、5.18) ，根據注藥方式不同，分別于手術前1 d和術后1、3、5、7、10、14 d檢測大鼠50%機械性撤足閾值。將大鼠置于金屬網架上，適應環境20～30 min后，首先從4.31開始，通過網眼將纖毛垂直刺向其雙側后肢足底中心處，稍用力直至彎曲成S形，刺激持續時間約為3～4 s，大鼠出現抬足或舔足行為視為陽性反應，若無反應則視為陰性反應。若縮足反應為陰性，則選擇相鄰遞增Von Frey Hair刺激，若縮足反應為陽性，則選擇相鄰遞減Von Frey Hair刺激，首次陽性反應后，應用Up-down法連續測量4次，每次間隔30 s，5次刺激中出現3次及3次以上陽性反應即認為發生機械痛覺超敏。

5.熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL)的測定

參照Hargreaves等[11]報道的方法，根據注藥方式不同，分別于手術前1 d和術后1、3、5、7、10、14 d測定大鼠TWL。調整輻射熱強度，使大鼠的基礎值維持在12～15 s，來設定熱測痛儀的參數。熱輻射照射時限設定為19.1 s。將大鼠置于玻璃板上，并罩以透明有機玻璃觀察框，大鼠適應環境30 min后，調整輻射光源使其對其大鼠后足足底中心處，光源開始照射足底部，當大鼠出現縮足反射或照射時間達到19.1 s，光源自動關閉，并自動記錄持續時間，即為熱痛閾值。正常對照大鼠的熱縮足潛伏期通常為12～15 s。每側足測量3次，每次間隔10～15 min，取其均值，作為該側足的熱縮足潛伏期。

6.酶聯免疫吸附法(ELISA)

測定脊髓 (SP) 及背根神經節 (dorsal root ganglion, DRG) 促炎癥細胞因子腫瘤壞死因子 -α (TNF-α)、白介素1β (IL-1β)以及白介素-6 (IL-6)表達測定。在連續注射RIS (0.5 mg/kg) 7 d后將大鼠斷頭處死，迅速截取L4-6脊髓腰膨大節段及雙側L4、L5背根神經節(DRG)。將組織用微量勻漿器制成勻漿液，采用BCA法測定蛋白濃度后，將蛋白量濃度統一稀釋為1 μg/μl。按照ELISA試劑盒說明書測定促炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量。將所需包被板條取出，像酶標孔中加入洗滌液300 μl/孔，靜置30 s，洗板5次，每次甩掉洗滌液后均需在吸水紙上拍干，盡快使用，避免包被板干燥。參照說明書稀釋標準品，再將稀釋好的標準品、樣本稀釋液和樣本加到相應孔中，100 μl/孔,用封板紙封住板條，置于室溫下 (20～25℃)孵育2 h。洗板5次。按當次實驗所需用量提前20 min配置生物素化抗體工作液，用抗體稀釋液將濃縮生物素化抗體稀釋到所需的濃度，100 μl/孔, 置于室溫下 (20～25℃) 用ELISA專用的微量振蕩器震蕩(100 rpm/min)孵育1 h。洗板5次。

采用Graphpad Prism 5.0軟件和SPSS 20.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準誤(±SEM)表示，對于大鼠疼痛行為學測試數據分析，比較采用雙因素方差分析，相同時間點兩組之間比較應用t檢驗；對于ELISA數據分析，差異性比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05為差異有統計學意義。按當次實驗所需用量提前20 min配制酶結合物工作液，用酶結合物稀釋液將濃縮鏈親和素標記的辣根過氧化物酶稀釋劑稀釋到所需的濃度，100 μl/孔，置于室溫下 (20～25℃) 用ELISA專用的微量振蕩器震蕩(100 rpm)孵育30 min。洗板5次。加顯色劑 (TMB)，100 μl/孔，室溫下反應，避光顯色10～20 min，顏色為藍色。加終止液，100 μl/孔，輕輕混勻，顏色呈黃色，在5 min內用酶標儀進行雙波長檢測（450 nm為主波長，570 nm或630 nm為參考波長）。

7.統計學方法

結 果

1.利塞膦酸鈉對SNL大鼠機械縮足反應閾值(MWT)的影響

各組術前1 d時MWT比較差異無統計學意義；與術前1 d相比，Sham + saline組、C組雙側、及SNL + saline組、R (M) 組對側各時間點MWT比較差異均無統計學意義。通過術前30 min至術后7 d皮下注射不同劑量RIS后，與Sham + saline組術側相比，SNL + saline組、R (L) 組、R (M) 組及R (H)組術側術后各時點MWT降低 (P＜ 0.05)，C組與Sham + saline組比較差異均無統計學意義；與SNL組術側比較，在術后3、5、7、10、14 d，R (M) 組術側 MWT 上升 (P＜ 0.05)，在術后 5、7、10、14 d R (H) 組術側 MWT 上升 (P＜ 0.05)，R (L) 組術側各時間點MWT比較差異無統計學意義；與R (M)組術側比較，在術后5、7、10、14 d時R (L)組及R (H) 組術側MWT較低 (P＜ 0.05)。結果證明，RIS可減輕神經損傷后大鼠機械性痛覺超敏，并在劑量為0.5 mg/kg時鎮痛效果更佳，而對大鼠正常痛閾無明顯作用（見圖1A，B）。

2.利塞膦酸鈉對脊神經結扎大鼠熱縮足潛伏期(TWL)的影響

各組術前1 d時TWL比較差異均無統計學意義；與術前1 d相比，Sham + saline組、C組兩側及SNL + saline組、R (M) 組對側各時間點比較差異均無統計學意義(P＜ 0.05)。與Sham + saline組術側相比，SNL + saline組、R (L)組及R (H) 組術側術后5、7、10、14 d TWL均降低 (P＜ 0.05)， R (M)組、C組與Sham + saline組比較差異無統計學意義；與SNL + saline組術側比較，在術后5、7、10、14 d，R (L) 組、R (M) 組及 R (H) 組術側TWL升高(P＜0.05)；與R (M)組比較，在術后5、7、10、14 d時R (L)組及 R (H) 組術側TWL較低 (P＜ 0.05)。結果證明，RIS可減輕神經損傷后大鼠熱痛覺過敏，并在劑量為0.5 mg/kg時鎮痛效果更佳，而對大鼠正常痛閾無明顯作用（見圖2A，B）。

圖1 術前30 min至術后7 d皮下注射RIS后各組大鼠不同時間點MWT的比較 (±SEM)(A)術側；(B)對側 *P ＜ 0.05，與Sham + saline組比較；#P ＜ 0.05，與SNL + saline組比較；△P ＜ 0.05，與R (M)組比較Fig.1 The change of MWT of rats at different time points after RIS injection (±SEM)(A) ipsilateral; (B) contralateral *P ＜ 0.05, compared with sham + saline rats; #P ＜ 0.05, compared with SNL + saline rats; △P ＜ 0.05, compared with group R (M).

3.利塞膦酸鈉對SNL大鼠背根神經節(DRG)中表達的影響

根據疼痛行為學數據分析結果，采取中劑量組0.5 mg/kg利塞膦酸鈉進行皮下注射，持續7 d，在術后7 d時，與Sham + saline組比較，SNL + saline組促炎癥細胞因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α表達水平升高(P＜ 0.05)；而與SNL + saline組相比，R (M)組中表達水平降低(P＜ 0.05)。結果證明，結果證明，RIS可下調神經損傷后大鼠脊髓(SP)及背根神經節(DRG)內促炎癥細胞因子的表達水平，進而對NP產生抗炎鎮痛作用 （見圖3A-C，4A-C）。

圖2 術前30 min至術后7 d皮下注射RIS后各組大鼠不同時間點TWL的比較 (±SEM)(A)術側；(B) 對側 *P ＜ 0.05，對側與 Sham + saline 組比較；#P ＜ 0.05，與 SNL + saline 組比較；△P ＜ 0.05，與R (M)組比較Fig.2 The change of TWL of rats at different time points after RIS injection (±SEM)(A) ipsilateral; (B) contralateral *P ＜ 0.05, compared with sham + saline rats; #P ＜ 0.05, compared with SNL + saline rats;△P ＜ 0.05, compared with group R (M).

圖3 術前30 min至術后7 d皮下注射RIS后各組大鼠術側SP促炎癥細胞因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α的表達變化 (±SEM)(A) IL-1β；(B) IL-6；(C) TNF-α *P ＜ 0.05，與 Sham + saline組比較；#P ＜ 0.05，與 SNL + saline組比較Fig.3 The change of pro-in fl ammatory cytokines levels in the spinal cord after RIS injection (±SEM)(A) IL-1β; (B) IL-6; (C) TNF-α *P ＜ 0.05, compared with sham + saline rats; #P ＜ 0.05, compared with SNL + saline rats.

圖4 術前30 min至術后7 d皮下注射RIS后各組大鼠DRG促炎癥細胞因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α的表達變化 (±SEM)(A) IL-1β；(B) IL-6；(C) TNF-α *P ＜ 0.05，與 Sham + saline組比較；#P ＜ 0.05，與 SNL + saline組比較Fig.4 The change of pro-in fl ammatory cytokines levels in the DRG after RIS injection (±SEM)(A) IL-1β; (B) IL-6; (C) TNF-α *P ＜ 0.05, compared with sham + saline rats; #P ＜ 0.05, compared with SNL + saline rats.

討 論

神經病理性疼痛的病理生理機制非常復雜，目前認為神經炎癥反應在其中起著重要的作用[12]。在神經損傷后，病理改變不僅僅局限于神經元系統活性的變化，還會引起免疫系統的反應，其中一些免疫細胞可分泌促炎癥細胞因子和趨化因子來參與疼痛維持[13,14]。一旦免疫系統激活，組織可釋放大量的炎性介質，包括一氧化氮(NO)，TNF-α，IL-1β，IL-6，興奮性氨基酸、ATP等[15]，這些炎性介質可降低激活閾值或者直接激發神經元。另外，由于鞘內給予IL-1β和TNF受體拮抗劑以及IL-6中和抗體會減弱神經病變模型中的疼痛行為[16]，因此已證明這些促炎癥細胞因子介導疼痛超敏反應。

第三代雙膦酸鹽[5]是骨吸收的抑制劑，利塞膦酸鈉可通過調節破骨及成骨細胞的活性、促炎癥細胞因子的表達、金屬蛋白酶-1 (MMP-1)的表達以及CGRP信號通路的活化等有效緩解骨質疏松癥、炎性痛、骨癌痛；但目前利塞膦酸鈉對于神經病理性疼痛的具體鎮痛機制尚不清楚。雙膦酸鹽類藥物可通過中樞及外周抑制急性痛，且鎮痛機制與骨破壞無關[17]；Bianchi和Nakai等[18,19]表明雙膦酸鹽類藥物能夠減少大鼠炎性痛模型中傷害感受增加時的炎癥性水腫和痛覺過敏。小鼠足底預先注射利塞膦酸鈉，可減少福爾馬林引起的組織內促炎癥細胞因子的表達（例如 TNF-α，IL-1β，IL-6）。Caraglia等[20]報道第三代雙膦酸鹽可抑制外周神經結扎所引起的神經病理性疼痛。這些研究表明利塞膦酸鈉可能通過調節神經系統內的神經化學物質的表達，從而對神經病理性疼痛產生鎮痛作用。

本實驗采用的脊神經結扎模型 (SNL) 已廣泛用于研究神經病理性疼痛的發病機制及治療方法，本研究結果表明術后大鼠出現了明顯的機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏,提示大鼠模型制備成功；同時表明，SNL大鼠持續注射RIS可減輕其因神經損傷所引起的痛覺過敏和痛覺超敏，并在第7天停藥后，鎮痛作用持續存在。并且R (M) 組及空白對照 (C) 組對側的行為學無明顯差異，表明不干擾正常的痛覺。本研究結果顯示，SNL大鼠術后脊髓 (SP) 及背根神經節 (DRG) 中的促炎癥細胞因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α表達明顯升高，在持續7天皮下注射RIS后，相應炎癥因子明顯下降，表明RIS可抑制神經病理性疼痛所引起的炎癥因子的表達，進而產生鎮痛作用。然而，利塞膦酸鈉有劑量依賴性的細胞毒性[21]，本研究結果顯示，0.5 mg/kg而非1 mg/kg的利塞膦酸鈉可以產生最佳的鎮痛作用，可能是因為1 mg/kg的劑量反而有毒性作用，但這需要進一步的研究去證實。

綜上所述，本研究結果顯示，利塞膦酸鈉可通過下調促炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達，可以抑制過度的炎癥反應，減輕神經的炎癥損傷，對SNL大鼠產生抗炎鎮痛作用，本文未對RIS抑制炎癥因子的具體機制進行探討，推測RIS抗神經病理性疼痛的作用可能與其抑制膠質細胞的活化進而下調促炎癥細胞因子的表達有關，該研究為RIS應用于抗神經病理性疼痛提供了實驗依據，其具體的作用機制還需要進一步探討。