張 琪，李白坤，朱繼民，劉竹青，蘇婧婧，李慶林

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學中西醫結合學院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫藥大學針灸推拿學院，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫藥大學科研實驗中心，安徽 合肥 230038)

藥物流產后沖任虛損，形體多虛多瘀，惡露排出不凈，瘀阻沖任，瘀血停積，阻礙新血歸經。基于中醫“瘀血不去、新血不生”治則，對產后血瘀證可用祛瘀生新法進行治療。許多研究已證實，桃紅四物湯對于婦科血瘀證療效顯著[1-2]?，F代醫學研究表明，流產后子宮內膜修復是減少產后子宮出血的重要環節，而子宮修復與子宮內膜血瘀狀態改善和子宮內膜血管新生密切相關[3]。內皮素-1(endothelin-1，ET-1)是迄今為止發現的作用最強的縮血管物質，其與一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)皆可通過影響血管內皮的舒縮功能進而影響血瘀狀態[4-5]。誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是NOS的一種亞型。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有顯著的誘導血管新生作用，與子宮內膜修復有關[6]；血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)主要分布于血管內皮表面，是可與VEGF進行特異性結合的高親和力受體，調節血管的生成。本研究旨在通過動物實驗，觀察桃紅四物湯對產后血瘀子宮的修復作用，探討其與ET-1、iNOS、VEGF和VEGFR-2的關聯性，為桃紅四物湯的作用機制研究奠定基礎。

1 材料

1.1 動物 SPF級健康SD大鼠100只，其中雌性70只、雄性30只，鼠齡10周，體質量220～250 g，由上海杰思捷實驗動物有限公司[動物生產許可證號為SCXK(滬)2013-0006]提供，常規飼養。本實驗獲得安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會的批準。

1.2 藥物 ①桃紅四物湯提取液的制備：桃紅四物湯(桃仁、當歸、白芍各9 g，紅花、川芎各6 g，熟地黃12 g)藥材購自合肥樂家老鋪中藥飲片有限公司，加入10倍量(容積與質量比)75%乙醇冷凝回流提取2 h后，倒出藥液，然后再用8倍量75%乙醇冷凝回流提取2 h，合并2次提取液，濃縮至含生藥含量為1.8 g/mL的提取液[7]。②益母草顆粒(國藥準字Z45021652，批號170107)購自廣西禪方藥業有限公司；米非司酮片(國藥準字H20033551，批號151201)購自湖北葛店人福藥業有限公司；米索前列醇(國藥準字H20000668，批號43160403)購自華潤紫竹藥業有限公司。

1.3 試劑與主要儀器 iNOS、ET-1及VEGF酶聯免疫吸附試驗試劑盒(批號均為201709)：上海碧云天生物科技有限公司；VEGFR-2抗體(批號ATQAU2306)：Abbkine公司；鼠抗(批號17042104)：北京中杉金橋生物技術有限公司。ELX800uv酶標儀：Bio-TEK公司；CK2型倒置顯微鏡：日本Olympus公司。

2 方法

2.1 模型復制與給藥 適應性飼養1周后，隨機留取8只雌性大鼠作為正常對照組，取雌鼠60只、雄鼠30只，于20：00以2∶1將其合籠，次日6：00進行陰道栓和陰道涂片鏡檢，以發現陰道栓和精子的當天為妊娠第1天。于妊娠第7天分別灌胃米非司酮(8.3 mg/kg，8：00)和米索前列醇(0.1 mg/kg，18:00)，給藥米索前列醇后向鼠陰道塞入適合大小的棉球。次日8：00和20：00取出棉球，若觀察到棉球上有血則判為早孕大鼠藥物流產[8]。大鼠流產第2天從眼內眥取血，肝素抗凝后，檢測血液流變學指標變化；若全血黏度在低切(1 s-1)≥45 mPa·s、高切(200 s-1)≥4.5 mPa·s則為血液流變性異常，按照文獻[3]方法判斷產后血瘀模型是否復制成功。選取模型復制成功的大鼠40只，隨機分為5組，每組8只，即桃紅四物湯高劑量(18.0 g/kg)、中劑量(9.0 g/kg)、低劑量(4.5 g/kg，相當于成人臨床用量的5倍)組，陽性對照組(益母草顆粒4.3 g/kg)和模型組(蒸餾水)；正常對照組給予蒸餾水。自由飲食，采用灌胃方式給藥(10 mL/kg)，每日2次，連續7 d。

2.2 指標觀察方法

2.2.1 子宮形態觀察與VEGFR-2檢測 末次給藥1 h后，用3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取出大鼠子宮組織拍照后用10%甲醛固定，經過石蠟包埋，切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，觀察大鼠的子宮形態學改變；然后按免疫組織化學試劑盒的要求，對切片進行免疫組織化學實驗，借助顯微鏡觀察大鼠子宮VEGFR-2的表達情況。

2.2.2 血清指標檢測 采集子宮組織的同時，腹主動脈取血，離心后吸取血清，采用ELISA試劑盒，借助ELX800uv酶標儀檢測iNOS、ET-1及VEGF水平。

3 結果

3.1 桃紅四物湯對大鼠子宮形態的影響 各組大鼠子宮的大體形態見文獻[9]。與正常對照組比較，模型組大鼠子宮色澤較暗，有水腫感，各給藥組大鼠子宮的色澤較模型組紅潤。HE染色后鏡下觀察子宮形態，發現正常對照組大鼠子宮內膜腺體較大，間質無水腫，無充血，管腔內無紅細胞聚集；模型組大鼠子宮內膜腺體較小，間質稍顯水腫，有充血，管腔內有紅細胞聚集；各治療組大鼠子宮內膜充血和水腫等血瘀表現較模型組好轉。見圖1。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.桃紅四物湯低劑量組；D.桃紅四物湯中劑量組；E.桃紅四物湯高劑量組；F.陽性對照組

圖1各組大鼠子宮組織形態學變化比較(HE染色，10×10倍)

3.2 桃紅四物湯對大鼠子宮VEGFR-2表達的影響 免疫組織化學染色后，子宮內膜中血管內皮細胞內表達的VEGFR-2被染成棕黃色；鏡下觀察發現正常對照組的棕黃色顆粒明顯多于模型組，各劑量組的棕黃色顆粒較模型組明顯增多。見圖2。

3.3 桃紅四物湯對大鼠血清VEGF、ET-1及iNOS水平的影響 模型組VEGF及iNOS均低于正常對照組(VEGF：t=9.587，P=0.000；iNOS：t=5.814，P=0.000)，但模型組ET-1高于正常對照組(t=-6.465，P=0.000)；各給藥組VEGF、iNOS及ET-1水平的差異均有統計學意義[VEGF：F(4，35)=55.774，P=0.000；iNOS：F(4，35)=7.726，P=0.000；ET-1：F(4，35)=11.304，P=0.000]，且與模型組相比，桃紅四物湯中劑量、高劑量組和陽性對照組VEGF及ET-1水平均明顯升高(P<0.05)，而iNOS水平則相對降低(P<0.05)，但桃紅四物湯低劑量組與模型組iNOS及ET-1水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.桃紅四物湯低劑量組；D.桃紅四物湯中劑量組；E.桃紅四物湯高劑量組；F.陽性對照組

圖2各組大鼠子宮組織VEGFR-2表達水平比較(免疫組織化學染色，10×20倍)

4 討論

桃紅四物湯能顯著改善產后血瘀狀態已為眾多臨床觀察和動物實驗[3,10-11]證實，其作用機制可能與調節NO、ET-1、VEGF、Ang-1、Ang-2等物質的表達水平有關[3,10,12-13]。但桃紅四物湯改善產后血瘀的作用是否與iNOS及VEGFR-2的表達水平有關尚未見報道。

本研究將VEGF與VEGFR-2組合，考察桃紅四物湯改善產后血瘀的作用是否與促進血管新生有關；將ET-1與iNOS組合，考察桃紅四物湯改善產后血瘀狀態是否與調節血管舒縮功能有關；從形態學和分子生物學的角度初步探討桃紅四物湯對產后血瘀子宮的修復作用，并從血管舒縮功能調節及血管新生的角度分析該復方促進血瘀子宮修復的可能機制。研究發現，桃紅四物湯具有顯著促進產后血瘀證大鼠子宮修復的作用，且該作用可能與桃紅四物湯下調血清ET-1的水平，上調iNOS水平，進而直接減弱血管收縮功能，間接增強血管舒張功能[8]，以及上調VEGF及VEGFR-2而發揮促進血管新生有關，結果與同類研究類似[3,12-13]。

表1 各組大鼠血清VEGF、ET-1及iNOS水平比較

注：與正常對照組比較；*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

桃紅四物湯源自清代吳謙等所著的《醫宗金鑒》，是中醫經典名方，由桃仁、當歸、白芍、紅花、川芎、熟地黃6味中藥組成。桃仁、紅花入血分，活血化瘀；川芎行血中之氣，行血活血；當歸活血補血；白芍養血柔肝，緩急止痛；熟地黃補血滋陰。諸藥合用，有活血化瘀、養血調經之效。本研究提示，桃紅四物湯促進產后血瘀大鼠子宮修復的作用可能與血清iNOS的水平及子宮組織VEGFR-2的表達水平有關，為進一步闡明桃紅四物湯的祛瘀生新作用機制提供參考。