復發性流產腎虛證小鼠子宮蛻膜組織miRNA表達譜檢測及生物信息學分析

王瑞雪，董小鵬，儲繼軍

(安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031)

復發性流產(repeated spontaneous abortion，RSA)是指3次或3次以上妊娠28周之前的胚胎或胎兒丟失。中醫學稱之為“數墮胎”或“滑胎”。RSA是一種常見妊娠并發疾病，據估計，人類妊娠中自然流產的發生率為50%～60%，RSA在育齡婦女中發病率為1%～5%[1]。RSA已經成為嚴重影響婦女生殖健康與安全的疾病，流產次數越多其復發風險越高。引起RSA的原因較多，可能包括先天遺傳、女性解剖異常、內分泌紊亂、盆腔感染因素、男性因素、心理因素及免疫因素等，但其確切機制尚未明了。細胞的功能起始于基因的表達，轉錄組概念上是指在某一時間階段個體細胞內所有基因轉錄形成的RNA的總稱[2]。對轉錄組的分析可以獲得高通量基因表達的RNA相關信息，從而揭示基因表達與某種生命現象之間的關系[3]。中醫的“證”，是對疾病過程中機體整體動態的階段性病理特征之概括，是人體整體病理狀態的實時反映，而這種狀態又是復雜多變的[4-5]。研究認為微小RNA(microRNA，miRNA)表達具有時序性、特異性，這種表達特點與中醫證候的上述特性相吻合，miRNA表達異常引起的相應基因網絡調控紊亂常常是導致疾病發生的重要內在原因[6]。因此，從miRNA調控角度研究正常妊娠和RSA腎虛證miRNA表達之間的相關性，探索RSA腎虛證和正常妊娠小鼠子宮蛻膜組織的miRNA差異表達譜，可能為該病的中醫辨證分型更加規范和客觀化提供依據。

1 材料

1.1 動物 采用SPF級CBA/J小鼠，6～7周齡，體質量(25±5)g，共25只；SPF級DBA/2小鼠，6～7周齡，體質量(25±5)g，共10只；SPF級BALB/c小鼠，6～7周齡，體質量(25±5)g，共3只。以上小鼠均由重慶恩斯維爾生物科技有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK(渝)2017-0003]提供，在SPF級實驗室適應1周。

1.2 主要試劑和儀器 高速臺式離心機(BACKMAN CS-15R)：美國Beckman公司；實時熒光定量PCR儀：加拿大Funglyn Biotech；電泳儀：美國Bio-rad；凝膠成像儀穩壓DNA電泳儀：美國Tianneng；GDS8000凝膠掃描系統：美國UVP；高速臺式離心機(BACKMAN CS-15R)：美國Beckman公司；水合氯醛：上海Aladdin；羥基脲：齊魯制藥有限公司；補腎安胎沖劑：安徽中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑。

2 方法

2.1 模型復制 采用具有隱性、反復性和父系特異性特征的DBA/2小鼠×CBA /J小鼠的Clark經典RSA小鼠模型[7]。RSA模型復制方法：將雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2按2∶1的比例于擬交配日18:00合籠，次日早上8:30檢查陰道栓。正常妊娠模型復制方法：將雌性CBA/J小鼠與BALB/c小鼠按2∶1的比例于擬交配日18:00合籠，次日早上8:30檢查陰道栓，肉眼觀察陰道口有無乳白色、固態膠狀物，發現明顯陰栓者為陽性。檢出陰栓的CBA/J小鼠計為妊娠第0天，進入下一步實驗。模型復制成功后小鼠分為兩組：正常對照組(正常妊娠小鼠)：予10 μL/g NaCl灌胃；模型組(RSA腎虛證小鼠)：妊娠第1～7天每日給予羥基脲450 mg/kg灌胃(藥物濃度為45 mg/mL，灌胃劑量10 mL/kg)+10 mL/kg NaCl灌胃；每組小鼠5只，共10只。注意觀察各組CBA/J小鼠一般狀態，每4 d稱量體質量，測量飲水和飼料1次并記錄。各組CBA/J小鼠腹腔注射麻醉并解剖后觀察子宮形態、顏色、宮口、宮腔內變化并記錄數據，剖視子宮觀察胚胎丟失情況并計算流產率；分離出各組子宮蛻膜組織，冰PBS緩沖液洗凈，-80 ℃保存用于后續檢測。

2.2 小鼠子宮蛻膜組織提取及RNA芯片處理 對正常妊娠小鼠(樣本編號A)及RSA腎虛證小鼠子宮蛻膜組織(樣本編號B)RNA的提取及純化步驟按AMBION抽提試劑盒使用說明書進行，樣品檢測結果均為A級合格，可進行下一步實驗。

2.3 RNA標記與芯片雜交 取100 ng總RNA，定容至2 μL。①配制去磷酸化混合液(CIP Master Mix)。PCR反應：37 ℃，30 min；樣品變性：在每管樣品中添加2.8 μL 100% DMSO混勻離心，將上述反應混合液置于100 ℃ PCR儀中5～10 min，再迅速轉入冰水浴中冷卻；連接標記：將10×T4 RNA Ligase Buffer置于37 ℃溫育并間隔渦旋，直至沉淀全部溶解，然后將其冷卻至室溫備用。②配制連接反應混合液(Ligation Master Mix)。PCR反應：16 ℃溫育2 h；標記后RNA純化，純化后樣品抽干，準備10×阻滯劑(Blocking Agent)。③配置反應體系(Hybridization Mix)。反應條件設置：100 ℃，5 min ；冰水5 min；上芯片，55 ℃ 20 h，20 r/min滾動雜交。④芯片洗滌：取出芯片洗滌，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)掃描得到原始圖像。

2.4 實時熒光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)驗證篩選出的miRNA 采用相對定量法對結果進行比較分析，以U6 RNA作為內參。首先進行RNA的提取，按照qRT-PCR的操作步驟，進行反轉錄反應條件設置：25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min；熒光定量PCR擴增條件設置：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環35次，72 ℃檢測信號。每個標本均采用3個復孔。

2.5 生物信息學分析方法 采用Feature Extraction 軟件 (Version 10.7.1.1，Agilent Technologies)處理原始圖像，提取原始數據。然后利用Genespring軟件(Version 13.1，Agilent Technologies)進行標準化過濾數據和后續數據統計。將至少有一組100%標記為“Detected”的探針篩選保留做下一步分析，對于無生物學重復者僅利用差異倍數值進行篩選，標準是差異倍數值≥2.0。然后應用3個數據庫(Targetscan，microRNAorg，pita)共同對差異miRNA進行靶基因預測，接著對所預測的靶基因進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析和基因本體(Gene Ontology，GO)分析，以判定差異miRNA所影響的細胞分子通路或者生物學功能。qRT-PCR驗證結果采用SPSS 17.0軟件進行兩個獨立樣本t檢驗，若P<0.05則視為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 RSA腎虛證小鼠子宮蛻膜組織表達上調倍數≥2的miRNA 與正常對照組比較，模型組子宮蛻膜組織表達上調倍數≥2的miRNA共有22條。見表1。

表1 RSA腎虛證小鼠子宮蛻膜組織表達上調倍數≥2的miRNA

3.2 RSA腎虛證小鼠子宮蛻膜中表達下調倍數≥2的miRNA 與正常對照組比較，模型組小鼠蛻膜中表達下調倍數≥2的miRNA共41個。見表2。

3.3 靶基因預測 從檢測出的差異表達的miRNA中選取變化較為明顯的14個miRNA(mmu-miR-7235-5p、mmu-miR-146a-5p、mmu-miR-155-5p、mmu-miR-185-5p、mmu-miR-192-5p、mmu-miR-202-3p、mmu-miR-328-3p、mmu-miR-34b-5p、mmu-miR-34c-5p、mmu-miR-483-5p、mmu-miR-676-3p、mmu-miR-700-3p、mmu-miR-872-5、mmu-miR-92b-3p)，通過3個數據庫(Targetscan，microRNAorg，pita)，共同對差異miRNA進行靶基因預測，結合既往自然流產基因檢測研究中證實的相關基因，共篩選出3 401個預測靶基因；分別選取其中上調的3個miRNA、下調的3個miRNA，列出其預測的部分靶基因。見表3。

3.4 qRT-PCR驗證結果 根據miRNA表達譜芯片檢測的結果，選取miR-92b-3p用實時熒光定量PCR再次驗證，逆轉錄引物：GCGCGTGAGCAGGCTGGAGAAATTAACCACGCGCGGAGGC，結果顯示其變化趨勢與芯片法的結果是吻合的，表明miRNA芯片檢測結果真實有效；熔解曲線顯示單峰者表明產物特異性良好。見表4。

3.5 GO分析 應用GO數據庫，針對靶基因作進一步功能富集分析，獲得差異miRNA 靶基因總數，對應的靶基因的顯著性基因功能的篩選以P<0.01為標準，富集積分(enrichment score)=-log10(P值)[8]。這些靶基因主要富集在轉錄調控、DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的陽性調控、多細胞生物發育、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的負調控以及蛋白轉導等多個生物過程方面。

3.6 KEGG通路富集分析 對這些靶基因進行調控通路分析，計算的結果會返回一個富集顯著性的P值，越小的P值表明靶基因在該通路中富集表達。以P<0.01為標準，Enrichment Score=-log10(P值)。排列在前20個顯著富集的KEGG通路表明，這些miRNA的異常表達可能與癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、細胞吞噬、肌動蛋白細胞骨架調控、黏著斑、軸突導向信號通路、MAPK信號通路、PAP-1信號通路等的激活有關。

4 討論

RSA是一種常見的妊娠并發疾病，其確切發病機制尚不十分明確。miRNAs是一組內源性的非編碼性RNA，是一類新發現的生物基因表達調控因子，其長度為19～24個核苷酸[9]。人類基因組中總共有1 048條miRNA，這些miRNA可以調控超過30%的基因，從而參與調控機體生長發育等許多復雜的生命過程。也就是說，一個mRNA可以接受多個miRNA調控，單個miRNA也可以調控多個mRNA[10]。這種現象表明miRNA分子是基因調控網絡中的核心組成部分。最近的研究更進一步發現miRNA失調與人類癌癥發生之間有密切的聯系[11]。而胚胎攜帶父系遺傳物質，相對于母體屬于“外來的”半同種移植物卻可被母體容受，胚胎著床于子宮的過程類似于腫瘤對機體的侵襲過程。有研究證明，在胚胎發育過程中miRNA具體重要作用[12]。如譚彬等[13]檢測了自然流產模型小鼠與正常妊娠小鼠子宮蛻膜組織差異表達的miRNAs，利用miRNAs芯片數據發現小鼠流產蛻膜組織和正常蛻膜組織之間有13個miRNAs存在明顯表達差異，預測軟件顯示miR-21和miR-26a的靶基因分別是和妊娠相關的金屬蛋白酶抑制因子RECK和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)兩個因子，因此認為小鼠子宮蛻膜組織miR-21和miR-26a的差異性表達可能在小鼠胚胎自然流產過程中具體關鍵作用。李怡等[14]研究認為，miR-10b可能促進了滋養細胞浸潤功能，參與了早期自然流產的病理過程。WANG等[15]發現miR-133a在自然流產中具體重要作用，推測miR-133a可能是通過抑制HLA-G的翻譯過程而參與了自然流產這一事件的發生。HU Y等[16]研究報道，pri-miR-125a的A-T單體型突變降低了miR-125a表達量，從而減弱了對靶基因LIF受體和ERBB2的有效抑制，可能與習慣性流產患者易患性有關。余秋波等[17]利用U133 plus 2.0芯片對自然流產絨毛和正常絨毛組織中絨毛外滋養細胞EVTs的基因表達譜進行檢測，發現與正常EVTs相比，在自然流產EVTs中，發現顯著上調基因219個，下調基因293個，認為與滋養層細胞粘附、免疫應答、水解酶及凋亡等相關基因的差異表達可能與滋養細胞侵襲行為變化及自流產有關。miRNA及其調節的特性與中醫治病求本機制有著密切的關聯性[18]。

中醫辨證論治因其確切穩定的療效，被廣泛應用于滑胎的治療。腎藏精，主生殖，為“先天之本”，腎氣腎精充足旺盛對女性生殖能力至關重要，是胞胎能夠在子宮正常著床發育的前提。張錫純《醫學衷中參西錄》云：“男女生育，皆賴腎氣作強，腎旺自能蔭胎也。”故“腎可系胎”，腎氣腎精虧虛常常引起自然流產甚至RSA。中醫公認腎虛證是滑胎的主要證型，現代著名中醫婦科醫家羅頌平亦認為腎虛不能固攝、腎氣虧虛是導致滑胎的主要病因，氣血、沖任二脈的耗損是其主要病機。

表2 RSA腎虛證小鼠子宮蛻膜組織表達下調倍數≥2的miRNA

表3 RSA腎虛證小鼠差異表達倍數≥2的miRNA及其預測靶基因

表4 正常妊娠小鼠與RSA腎虛證小鼠蛻膜miR-92b-3p表達水平比較

注：ΔCt=目的基因Ct-內參基因Ct；相對表達量=2(-ΔCt)；相對比值=目的基因相對拷貝數/內參基因相對拷貝數；與正常對照組比較，*P<0.05

本研究通過差異基因篩選尋找出63條表達顯著的差異基因，由于本研究中異常調節的miRNA所調控的靶基因較多，通過對miRNA所調控的靶基因進行GO分析，構建RSA蛻膜組織差異miRNA與靶基因功能調控網絡，得出處于網絡核心調控位置的miRNA所調控的靶基因進行GO分析，構建RSA蛻膜組織差異miRNA與靶基因功能調控網絡，得出處于網絡核心調控位置的miRNA、被調控的核心靶基因以及多個關鍵性基因功能。上述差異基因表達產物通過各種方式影響了轉錄調控、DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的陽性調控、多細胞生物發育、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的負調控、蛋白轉導等多種生物學過程，其中又涉及多種信號通路的改變，如癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、細胞吞噬、肌動蛋白細胞骨架調控、黏著斑、軸突導向信號通路、MAPK信號通路、PAP-1信號通路等。這一結果證實了RSA腎虛證的形成可能是由其基因表達異常，進一步引起機體多種細胞生物學反應的復雜化多樣化過程。

本研究從基因水平展開研究，結果初步顯示兩個證型間存在著差異表達基因譜，這也說明中醫臨床證型的分類具有特定的生理指標和特定的差異表達基因的依據[2]。因本研究的樣本量仍不夠大，其結果還有待下一步擴大樣本量進行驗證，從而為闡明中醫“證”本質提供更加客觀的生物學標志物，亦有利于深入了解中藥在RSA治療中的分子和基因調控機制。