妊娠期肝內膽汁淤積癥患者肝功能、胎盤組織中HSP70、HIF-1α的表達變化及其意義

楊琳 李慧敏 朱艷

妊娠期肝內膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是臨床上較為常見的妊娠期并發癥，流行病學研究顯示，ICP的發病率持續性維持在334～566/10萬人左右，在合并有膽道系統疾病的孕產婦中，ICP可呈現出明顯的高發態勢[1-2]。

ICP可以影響到胎盤的氧化應激反應、促進高膽汁酸代謝，進而導致胎兒宮內急性缺氧，但其發病機制仍然缺乏可靠的臨床研究。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)等細胞炎癥因子或者氧化應激誘導因子，能夠在促進高膽汁酸代謝情況下的胎盤滋養細胞凋亡、增加胎盤微血管的血栓形成，影響到胎盤局部血流灌注的穩定性等，進而促進胎兒宮內急慢性缺氧，導致胎兒及母體不良妊娠結局的發生[3]。為了進一步揭示ICP患者肝功能、胎盤組織中HSP70、HIF-1α的表達變化，本研究選取本院產科確診的ICP患者69例，探討相關指標的表達及其與患者病情嚴重程度的關系，為臨床上ICP患者的臨床預后評估或者早期診斷提供參考。

資料與方法

1.一般資料：選取本院產科確診的ICP患者69例作為ICP組，收治時間2015年1月—2017年1月，選取同期正常妊娠婦女60例作為對照組。ICP組，年齡24～39歲，平均(29.8±3.2)歲；孕周34～39周，平均(36.7±1.8)周；孕次(2.2±0.7)次，產次(0.8±0.5)次，依據《婦產科學》第八版中的ICP病情劃分標準[4]，分為輕度和重度，其中輕度ICP患者41例，重度ICP患者28例。對照組，年齡23～39歲，平均(29.5±4.7)歲；孕周36～41周，平均(38.8±1.5)周；孕次(2.0±0.8)次，產次(0.9±0.4)次。兩組的年齡、孕次、產次比較，差異均無統計學意義。

2.納入和排除標準：納入標準包括(1)ICP的診斷標準、病情分度參考中華醫學會制定的標準[4]；(2)納入研究對象均接受剖宮產手術；(3)本研究獲得醫學倫理委員會的批準及研究對象的知情同意。排除標準包括(1)合并其他病毒感染性疾病；(2)妊娠前伴有病毒性肝炎、肝腎功能疾病；(3)合并胎膜早破、妊娠糖尿病、妊娠高血壓、結締組織疾病等其他妊娠合并癥。

3.肝功能指標檢測：檢測兩組妊娠婦女的血清甘膽酸(Glycocholic acid，GC)、總膽汁酸(Total bile acid，TBA)、丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(Total bilirubin，TBIL)。采集患者肘部靜脈血3 ml，加入抗凝劑2 ml，1 000 r/min離心(離心半徑10 cm)5 min，采用生物酶聯免疫吸附實驗檢測相關指標，CG、TBA、ALT、AST、TBIL檢測試劑盒購自羅氏生物檢測應用公司，配套試劑及儀器購自南京伯斯金生物科技有限公司。

4.胎盤組織HSP70、HIF-1α檢測：采用石蠟切片脫蠟至水，采用離子水進行反復洗滌，加入牛奶液體封閉抗體，封閉時間為5 min，加入HSP70、HIF-1α抗體(鼠來源，ABCUM公司),37℃孵育 2 h，采用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，滴加熒光染色標記的二抗抗體(購自abcum公司)，37℃孵育 30 min，加入磷酸鹽緩沖液進行洗滌，采用南京凱基生物制劑公司生產的顯色劑進行顯色，封片，鏡下觀察。

5.免疫組化結果判定：HSP70、HIF-1α蛋白的陽性著色表達于細胞漿或細胞核，呈黃色、棕黃色、褐色表達。根據著色強度，0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為褐色、黑色；根據陽性細胞比例，陽性細胞數目所占比例≤10%為1分，陽性細胞所占比例11%～50%為2分，陽性細胞數51%～75%為3分，陽性細胞數所占比例>75%為4分；兩種積分相乘總分<3分為陰性，總分≥3分為陽性；總分<3分，用 “-”表達；總分為3～5分，用“+”表達；總分<為6～9分，用“++”表達；總分>9分，用“+++”表達。

結果

1.兩組妊娠婦女肝功能相關指標比較:ICP組患者的血清GC、TBA、ALT、AST、TBIL水平均顯著高于對照組，差異均有統計學意義。見表1。

2.兩組妊娠婦女胎盤組織中HSP70、HIF-1α蛋白表達程度比較：ICP組患者的HSP70和HIF-1α蛋白表達程度和陽性表達率均顯著高于對照組，差異均有統計學意義，見表2。

3.不同病情ICP患者肝功能相關指標比較：重度ICP組患者的血清GC、TBA、ALT、AST、TBIL水平均顯著高于輕度ICP組，差異均有統計學意義，見表3。

4.不同病情ICP患者胎盤組織中HSP70、HIF-1α蛋白表達程度比較：重度ICP組患者的HSP70、HIF-1α蛋白表達程度顯著高于輕度ICP組，差異均有統計學意義，見表4。

表1 兩組妊娠婦女肝功能相關指標比較

注：與對照組比較，*P<0.05

表2 兩組妊娠婦女胎盤組織中HSP70和HIF-1α蛋白表達程度比較 [例(%)]

注：兩組比較，*P<0.05

表3 不同病情ICP患者肝功能相關指標比較

注：與輕度組比較，*P<0.05

表4 不同病情ICP患者胎盤組織中HSP70和HIF-1α蛋白表達程度比較 [例(%)]

注：兩組比較，*P<0.05

討論

ICP的發病機制較為復雜，膽道系統疾病、先天性遺傳易感基因的攜帶等，均可能影響到孕期血清中膽汁酸水平的升高和促進ICP的發生。ICP能夠在下列幾個方面影響到孕產婦的臨床結局[5-6]：(1)ICP增加了孕產婦妊娠晚期肝功能損傷、凝血功能障礙或者多器官功能障礙的發生風險；(2)ICP增加了胎兒宮內窘迫的發生風險，導致胎兒生長發育畸形的風險增加，胎兒宮內生長受限或者新生兒窒息的發生率也明顯上升。現階段臨床上長期的隨訪研究發現，ICP的早期診斷水平較低，35%左右的孕產婦在診斷ICP時已合并有明顯的器官功能損傷[7]。本研究通過對于HSP70、HIF-1α蛋白的表達變化，不僅能夠為臨床上ICP患者的診斷提供前期參考指標，而且還能夠為ICP的病情嚴重程度的評估提供依據。

HSP70是熱休克家族的重要成員，其能夠在炎癥反應、氧化應激反應或者自身性免疫損傷等方面發揮一定的作用。HSP70能夠誘導下游炎癥細胞如單核細胞或者中心粒細胞等的富集，導致患者細胞膜完整性的破壞[8]，增加細胞炎癥因子對胎盤絨毛膜滋養細胞或者合體滋養層細胞的浸潤，導致胎盤功能退化，影響到胎兒的供應及血流的灌注[9]。 HIF-1α是缺氧誘導因子，其表達濃度的改變是影響到缺氧再灌注損傷的啟動因子，能夠在加速胎盤血管內皮細胞的線粒體損傷，增加胎盤微血栓的形成方面發揮作用。HIF-1α還可以影響到肝細胞對于膽汁酸的代謝，導致膽汁酸的分解利用障礙，血清中膽汁酸水平的持續性上升可以導致孕產婦胎兒組織器官的直接損傷[10]。

CG、TBA、ALT、AST和TBIL等指標是評估ICP患者肝功能損傷程度的重要指標，相關指標的上升往往提示患者肝臟細胞膜的破壞，肝臟代償功能的下降。本研究ICP患者血清中相關肝功能損傷指標明顯上升，高于正常對照孕產婦，差異具有統計學意義。這可能與ICP患者體內高膽汁酸代謝，導致患者肝臟細胞膜的氧化性損傷，或者與膽汁酸的直接對于肝臟細胞膜的促分解作用有關。ICP患者胎盤組織中HSP70、HIF-1α蛋白表達陽性率的上升，則提示HSP70、HIF-1α可能參與到了ICP患者病情持續性進展過程中，二者的高表達能夠在下列幾個方面影響到ICP的母嬰不良妊娠結局[11-12]：(1)HSP70的表達，影響到胎盤滋養細胞的成熟及分化，導致濾過或者營養物質交換功能的障礙；(2)HIF-1α蛋白的高表達，能夠加劇下游IL-6或者IL-10等細胞炎癥因子的高表達，促進其對于胎盤血管的毒性損傷作用，同時高表達的HIF-1α蛋白還可以導致自然殺傷性T淋巴細胞對于臍動脈的痙攣性損傷，引起臍動靜脈血流灌注動力學的紊亂。章易琳等[13- 14]在嚴重母嬰不良結局的ICP孕產婦的胎盤組織中檢測相關蛋白的表達后發現，ICP胎盤組織中HSP70、HIF-1α蛋白等的異常表達，與胎盤功能、胎盤血管的阻力及胎兒宮內生長受限等指標均密切相關。但也有部分研究認為，HSP70、HIF-1α蛋白的表達只有在中度或者重度ICP患者中才存在差異性的表達[4]，本研究與此存在一定的不同，可能與ICP患者的膽汁酸水平的差距、肝臟代償功能等的差異有關。另外，本研究發現在不同嚴重程度的ICP患者中，HSP70、HIF-1α蛋白或者CG、TBA、ALT、AST、TBIL等肝功能指標呈現出了明顯的線性表達差異，病情越為嚴重，相關指標的表達越高，臨床上可以通過評估HSP70、HIF-1α蛋白等，進而為ICP的病情評估提供參考。

本研究的創新性在于探討了HSP70、HIF-1α蛋白等指標在胎盤組織而非血清中的異常表達，并揭示了其與患者病情嚴重程度的關系。綜上所述,ICP患者血清CG、TBA、ALT、AST、TBIL水平及胎盤組織中HSP70、HIF-1α蛋白表達水平均顯著升高，并且與病情程度密切相關。