黃芪總黃酮對骨關節炎軟骨細胞氧化應激和炎癥因子分泌的影響

任偉亮，焦永偉，張 健，王 響，齊立卿，杜雙慶

河北省中醫院骨三科 石家莊 050011

骨關節炎是一種常見的退行性疾病，其發生與關節軟骨損傷有關。正常的軟骨組織由軟骨細胞和軟骨基質組成，其中軟骨細胞不僅可以清除壞死退變的基質，還可以不斷合成新的基質，維持關節軟骨的正常功能[1]。黃芪總黃酮是一種從蒙古黃芪中分離出來的抗氧化活性成分，研究[2-4]顯示，黃芪總黃酮具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗損傷等生物學作用。研究[5]還顯示，黃芪總黃酮具有治療關節炎的作用，黃芪總黃酮處理可以減少關節炎性細胞浸潤，抑制炎癥反應。本實驗通過分離骨關節炎軟骨細胞，探討黃芪總黃酮對骨關節炎軟骨細胞炎癥反應和氧化應激的作用，為黃芪總黃酮治療骨關節炎提供依據。

1 材料與方法

1.1材料本實驗所用的骨關節炎軟骨組織均來源于2017年3月河北省中醫院膝關節置換術患者，標本保存在液氮中。超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒購自碧云天生物研究所；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司；NF-κB p65亞型(NF-κBp65)抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)抗體購自上海研晶生物技術有限公司；白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)含量檢測試劑盒購自北京熱景生物技術股份有限公司；黃芪總黃酮購自西安恒堡生物科技有限公司。

1.2骨關節炎軟骨細胞的分離培養參照文獻[6]分離培養骨關節炎軟骨細胞，在無菌條件下將骨關節炎軟骨組織用1.5 g/L的膠原酶消化以后，用含青、鏈霉素的DMEM培養液(培養液中添加體積分數10%胎牛血清)培養。以22目細胞篩過濾以后，1 000×g離心10 min。用不含血清的DMEM將細胞懸浮，1 000×g離心10 min，棄上清。把分離的細胞種植到細胞培養瓶中，每3 d換液1次，細胞融合度超過90%時，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代。

1.3MTT法檢測細胞增殖能力取第3代骨關節炎軟骨細胞接種至96孔細胞培養板中，每個孔中添加3 000個細胞，培養過夜以后，將細胞培養液換成含有0、5、10、20 mg/L的黃芪總黃酮細胞培養液，每個濃度3個復孔，繼續培養72 h以后，將培養板從培養箱中取出，每孔添加20 μL MTT溶液，常規方法培養4 h以后，把孔內的液體吸除，添加DMSO溶液150 μL，振蕩孵育10 min后，將培養板置于酶標儀中，將波長調整為490 nm，測定每孔的OD值。實驗重復3次。

1.4ELISA法檢測培養上清中IL-6、IL-1β水平取第3代骨關節炎軟骨細胞，經過0、5、10、20 mg/L的黃芪總黃酮細胞培養液培養72 h以后，收集培養上清，ELISA法檢測上清中IL-6、IL-1β含量，步驟同試劑盒說明。實驗重復3次。

1.5細胞培養上清中SOD、GSH-Px活性檢測取第3代骨關節炎軟骨細胞，經過0、5、10、20 mg/L的黃芪總黃酮細胞培養液培養72 h以后，收集培養上清，用WST-8法檢測SOD活性，用ELISA法檢測GSH-Px活性，步驟均參照試劑盒說明。實驗重復3次。

1.6Western blot檢測NF-κBp65、MMP-13蛋白表達水平0、5、10、20 mg/L的黃芪總黃酮處理72 h以后，收集各組細胞，在細胞中添加含有1 mmol/L PMSF的裂解液，置于冰上裂解。4 ℃高速離心以后，取上清液轉移到離心管中，保存于-80 ℃。在蛋白中按照1∶4的體積比添加適量的Loading Buffer混勻后煮沸5 min。用BCA法進行定量。配制100 g/L的分離膠、50 g/L的濃縮膠。按照蛋白樣品50 μg進行上樣，電泳，轉膜，轉膜電流為250 mA。將NC膜置于一抗反應液(NF-κBp65以1∶600稀釋、MMP-13以1∶800稀釋)中反應過夜后，再置于二抗反應液中室溫孵育2 h，二抗以1∶2 000稀釋，滴加ECL發光液。采用Quantity-One軟件分析條帶的灰度值，以β-actin作為參照，目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。實驗重復3次。

1.7統計學處理數據采用SPSS 21.0進行分析。4組細胞OD值，培養上清中IL-6、IL-1β含量及SOD、GSH-Px活性，MMP-13、NF-κBp65蛋白表達水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.14組細胞增殖能力的比較MTT結果顯示，細胞OD值隨著黃芪總黃酮濃度的升高而升高。見表1。

表1 4組細胞OD值及培養上清中IL-6、IL-1β含量的比較(n=3)

*：與0 mg/L組比較，P<0.05；#：與5 mg/L組比較，P<0.05；△：與10 mg/L組比較，P<0.05

2.24組細胞培養上清中IL-6、IL-1β含量的比較ELISA檢測結果顯示，細胞培養上清中IL-6、IL-1β含量隨著黃芪總黃酮濃度的升高而降低。見表1。

2.34組細胞培養上清中SOD、GSH-Px活性的比較結果顯示，細胞培養上清中SOD、GSH-Px活性隨著黃芪總黃酮濃度的升高而升高。見表2。

表2 4組細胞培養上清中SOD、GSH-Px活性及MMP-13、NF-κBp65蛋白表達水平的比較(n=3)

*：與0 mg/L組比較，P<0.05；#：與5 mg/L組比較，P<0.05；△：與10 mg/L組比較，P<0.05

2.44組細胞MMP-13、NF-κBp65蛋白表達水平的比較Western blot檢測結果顯示，細胞中MMP-13、NF-κBp65蛋白表達水平隨著黃芪總黃酮濃度的升高而降低。見圖1和表2。

1：0 mg/L組；2：5 mg/L組；3：10 mg/L組；4：20 mg/L組

3 討論

黃芪屬于豆科黃芪屬植物，其含有多種活性成分，黃芪總皂苷、黃芪總黃酮、黃芪總多糖等是其主要的活性成分，其中黃芪總黃酮含有6種單體，具有提高免疫細胞活性、減輕氧化損傷、抑制突變、抗失血性休克等功效[7]。有研究[8]報道，黃芪總黃酮具有保護關節軟骨的作用，其可以減輕關節軟骨炎癥因子釋放。本實驗結果表明，黃芪總黃酮處理后的關節炎軟骨細胞增殖活性升高，細胞培養上清中炎癥因子IL-6、IL-10水平降低，說明黃芪總黃酮具有抑制關節炎軟骨細胞炎癥因子釋放的作用。

骨關節炎是一種慢性疾病，關節功能破壞是其主要的病理變化，氧化應激是關節軟骨損傷發生的重要原因[9]。氧化應激是指機體受到炎癥因子等各種有害刺激以后產生過量的氧自由基或導致機體內抗氧化能力降低，從而引起氧自由基在機體內積累，導致機體氧化還原狀態受到破壞，引起氧化損傷[10-12]。SOD、GSH-Px是抗氧化酶，可以將細胞內過量的氧自由基清除，是機體內抗氧化系統的重要組成部分[13]。黃芪總黃酮具有清除氧自由基、抗氧化損傷的作用，目前在肝損傷、紫外線損傷等過程中已被證實[14]。本實驗結果顯示，黃芪總黃酮處理后的骨關節炎軟骨細胞培養上清中SOD、GSH-Px活性升高，提示黃芪總黃酮可以通過提高細胞內抗氧化酶的活性發揮保護關節細胞的作用。

正常情況下，軟骨細胞可以分泌大量的蛋白多糖，這些蛋白多糖能夠被基質金屬蛋白酶降解，從而維持細胞支撐力量的循環和平衡；受損的軟骨細胞可以分泌過量的基質金屬蛋白酶，導致上述平衡受到破壞，引起軟骨細胞支撐力量缺失，誘導骨關節炎的發生[15]。基質金屬蛋白酶是細胞外基質降解的重要源頭，MMP-13能夠將Ⅱ型膠原、Ⅰ型膠原和蛋白聚糖等降解，其中Ⅱ型膠原是軟骨膠原的主要組成部分，其與蛋白聚糖共同維持軟骨的彈性[16]。本研究結果表明，黃芪總黃酮能夠抑制骨關節炎軟骨細胞中MMP-13的表達，黃芪總黃酮可以通過抑制細胞外基質降解發揮抗骨關節炎的作用。

NF-κB是一個與炎癥、細胞生長、氧化損傷等密切相關的信號通路，其可以誘導下游炎癥因子釋放，促進炎癥反應，引起細胞氧化應激。NF-κBp65是NF-κB二聚體形成的必需組成單位，也是NF-κB信號功能發揮的關鍵[17]。NF-κB在骨關節炎軟骨組織中過度激活，NF-κBp65在骨關節炎軟骨組織中的表達水平升高，白藜蘆醇等藥物可以通過下調NF-κB信號的激活抑制骨關節炎軟骨組織的炎癥反應[18-19]。黃芪總黃酮具有抗炎和負調控NF-κB信號的作用[20]。本實驗結果表明，黃芪總黃酮處理后骨關節炎軟骨細胞中的NF-κBp65蛋白表達水平降低，提示黃芪總黃酮可以通過抑制NF-κB信號通路激活發揮抗炎、抗氧化的作用。

綜上，黃芪總黃酮能夠抑制骨關節炎軟骨細胞的炎癥反應和氧化應激，其作用機制可能與下調NF-κB信號有關。這為以后研究黃芪總黃酮抗骨關節炎的作用機制提供了依據，為骨關節炎的治療提供了參考。