過表達受體活性修飾蛋白-1對人氣道平滑肌細胞增殖和細胞周期的影響

吳 雷，葉樹培，黃玉娥，陳翠儀，陳美華

東莞市第三人民醫院呼吸內科 廣東東莞 523326

支氣管哮喘是一種由肥大細胞、嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、氣道上皮細胞等炎癥細胞和細胞組分所介導的具有復雜免疫機制的氣道慢性過敏反應性疾病[1]。氣道重塑是哮喘的重要特征，也是引起哮喘不可逆氣流阻塞、難治性哮喘和激素抵抗的重要原因之一[2]。平滑肌細胞異常增殖是氣道重塑的主要機制[3]。因此，探究氣道重塑過程中平滑肌細胞異常增殖的分子機制，對于哮喘的防治具有重要意義。降鈣素基因相關肽 (calcitonin gene related peptide，CGRP)是一種新的神經肽，其表達升高可減輕哮喘大鼠氣道炎癥及高反應性[4]。受體活性修飾蛋白-1(receptor activity modifying protein-1, RAMP-1)是CGRP家族受體的重要組成部分。既往研究[5]證實，血管平滑肌細胞中RAMP-1與CGRP表達呈正相關，且RAMP-1過表達是CGRP抑制血管平滑肌細胞增殖的主要機制。RAMP-1在哮喘中的作用目前尚未闡明。因此，本研究以人氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)為研究對象，將pcDNA3.1-RAMP-1轉染ASMCs，旨在探討RAMP-1對ASMCs增殖和細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器DMEM培養基、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000試劑盒均購自美國Invitrogen；pcDNA3.1和pcDNA3.1-RAMP-1購自上海索萊寶生物有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；BCA試劑盒購自美國Thermo公司；RNase、PI均購自江蘇凱基公司；RAMP-1、IκBα、p65NF-κB、PCNA、CyclinD1抗體均購自美國CST公司；酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2ASMCs的分離培養采用組織塊貼壁培養法。患者及家屬知情同意后，無菌條件下取東莞市第三人民醫院肺部良性腫瘤肺葉切除術患者的正常肺葉段支氣管標本(組織標本均經病理學確診)。去除周圍結締組織、軟骨和血管后，預冷PBS沖洗。轉移組織塊至含血清的青霉素小瓶中，將其剪成1 mm3大小組織塊，均勻鋪在培養瓶底部，加含FBS的DMEM培養液，于體積分數5%CO2、37 ℃孵箱中培養，2 h后觀察到組織塊貼壁，翻轉瓶底。繼續培養，每3～5 d換液1次。胰蛋白酶消化傳代。

1.3實驗分組取3～8代ASMCs，待細胞達60%～70%生長融合時進行轉染。實驗分為空白組(不作轉染)、pcDNA3.1組(轉染pcDNA3.1)和pcDNA3.1-RAMP-1組(轉染pcDNA3.1-RAMP-1)，每組3孔。轉染參照LipofectamineTM2000試劑盒說明操作。48 h后，Western blot檢測RAMP-1蛋白轉染效果。實驗重復3次。

1.4CCK-8法檢測細胞增殖取3～8代ASMCs，以每孔3 000個細胞接種于96孔板，每孔100 μL。按1.3分組，于轉染24、48和72 h后，每孔中加入10 μL CCK-8試劑，于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱培養2 h，酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度(A)值。實驗重復3次。

1.5流式細胞術檢測細胞周期取3～8代ASMCs，接種于75 cm2培養瓶中，于培養箱中培養，細胞達80%融合時，吸棄舊的培養液，加入含FBS的DMEM培養液，過夜，使細胞同步靜止于G0期。按照1.3分組處理，于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱孵育48 h，胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液，收集于離心管中。離心，棄上清，預冷PBS洗滌細胞，離心，棄上清，4 ℃預冷乙醇輕吹細胞使之完全重懸，4 ℃固定2 h，離心，收集固定細胞，PBS洗滌重懸細胞，并將細胞轉移至EP管中，輕輕吹打，加10 μL RNase(10 g/L)，37 ℃水浴10 min，再加入5 μL PI 37 ℃避光水浴染色30 min，過300目篩網。上流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復3次。

1.6Western blot檢測細胞中p65NF-κB、IκBα、PCNA和CyclinD1蛋白的表達細胞轉染48 h，使用適量的裂解液提取細胞總蛋白，BCA法對蛋白濃度進行檢測。配制120 g/L分離膠及50 g/L濃縮膠，按照40 μg/孔上樣蛋白，經SDS-PAGE、轉膜、封閉后，洗膜，加入一抗稀釋液(稀釋濃度1∶800)，4 ℃搖床孵育過夜，洗膜，加HRP標記的二抗稀釋液，洗膜，室溫搖床孵育1.0～1.5 h，ECL顯色，曝光，采集圖像，Quantity One軟件分析。以目的蛋白與內參(GAPDH)灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0分析，各組細胞RAMP-1蛋白表達，增殖情況，細胞周期和p65NF-κB、IκBα、PCNA、CyclinD1蛋白表達的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組細胞RAMP-1蛋白的表達見圖1和表1，pcDNA3.1-RAMP-1組RAMP-1表達升高。

2.2各組細胞增殖情況比較結果見表2。

1～3：分別為空白組、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-RAMP-1組

F=271.702，P<0.001；*：與空白組和pcDNA3.1組比較，P<0.05

表2各組細胞增殖A值比較(n=3)

*：與空白組和pcDNA3.1組比較，P<0.05

2.3各組細胞周期比較結果見表3。pcDNA3.1-RAMP-1組G0/G1期細胞比例升高，而S期和G2/M期細胞比例降低。

表3各組細胞周期比較

(n=3) %

*：與空白組和pcDNA3.1組比較，P<0.05

2.4各組細胞中NF-κB信號通路蛋白p65NF-κB、 IκBα、PCNA和CyclinD1的表達見圖2和表4。pcDNA3.1-RAMP-1組IκBα表達升高，p65NF-κB、PCNA和CyclinD1表達均降低。

1～3：分別為空白組、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-RAMP-1組

圖2各組細胞中p65NF-κB、IκBα、PCNA和CyclinD1蛋白的表達

表4 各組細胞中p65NF-κB、 IκBα、PCNA和CyclinD1蛋白的相對表達量(n=3)

*：與空白組和pcDNA3.1組比較，P<0.05

3 討論

支氣管哮喘是一種常見的慢性疾病，近些年其發病率和病死率仍在不斷上升，氣道重塑是哮喘的關鍵特征之一，平滑肌細胞、上皮細胞、成纖維細胞、T輔助細胞等均參與哮喘的氣道重塑過程[6]。ASMCs是氣道重塑過程中主要的結構成分之一，參與哮喘的病理過程(氣道重塑、氣道炎癥和氣道高反應性)[7]。現有研究[8]發現，哮喘時ASMCs數目增加、體積增大、凋亡減少，氣道壁明顯增厚。因此，抑制哮喘過程中ASMCs增殖對于哮喘治療有重要意義。

CGRP在體內廣泛分布和表達，具有肺功能保護、神經系統保護、心血管系統保護、骨損傷修復等多種生物學活性[9-10]。RAMP-1是CGRP受體之一，是受體調節的限速蛋白[11]。有研究[12]顯示，構建大鼠RAMP-1基因開放閱讀框的真核表達載體，并將其轉染入大鼠主動脈平滑肌細胞，可明顯增強CGRP抑制的血管平滑肌細胞增殖。CGRP修飾的骨髓間充質干細胞能明顯抑制血管平滑肌細胞的表型轉化及細胞增殖，這可能與CGRP受體表達上調增強CGRP效應性有關[13]。本研究發現過表達RAMP-1可明顯抑制ASMCs增殖，阻滯細胞周期進程。這與以往研究相符，提示過表達RAMP-1也可能是哮喘治療的途徑之一。

NF-κB是一個多向性核轉錄調節因子，目前研究[14-15]認為，NF-κB信號通路參與炎癥、免疫反應、感染、細胞凋亡等多種生理和病理過程。NF-κB活化與支氣管哮喘等疾病密切相關[16]。有研究[17]顯示，增加胞漿IκBα含量，抑制NF-κB表達和激活，可有效抑制哮喘氣道炎癥；RAMP-1對可促進血管平滑肌細胞遷移，機制與抑制NF-κB信號通路有關[18]。NF-κB信號通路對細胞生物學特性的影響與調節的下游靶基因有關。PCNA是一種核內蛋白，其表達水平可反映細胞增殖情況，哮喘中氣道平滑肌細胞PCNA表達水平升高[19]。CyclinD1是一個細胞周期蛋白，在調節細胞周期G1期向S期轉變過程中發揮重要作用，主要存在于氣道平滑肌細胞，在哮喘中表達水平升高[20]。本研究結果顯示，過表達RAMP-1可上調ASMCs中IκBα蛋白的表達，下調p65NF-κB、PCNA和CyclinD1蛋白的表達，提示RAMP-1對ASMCs生長的影響與抑制NF-κB信號通路有關。

綜上所述，過表達RAMP-1可抑制ASMCs增殖，阻滯細胞周期，機制與抑制NF-κB信號通路有關。RAMP-1可能是哮喘治療的有效干預靶點，但還需更多研究證實。