液態活檢方法檢測晚期非小細胞肺癌患者EGFR突變及臨床分析

鄭晉 張秋蕊 周靈 戴然然 周敏 丁永杰

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院呼吸與危重癥醫學科 上海交通大學醫學院呼吸病研究所 200025

2018年我國國家癌癥中心公布的最新癌癥數據顯示,肺癌為我國癌癥發病率及病死率第一位[1]。根據2015年公布的全球腫瘤流行病學統計數據 (GLOBOCAN 2012),2012年全球約有180萬的患者被確診為肺癌,數目約占所有確診癌癥的13%,居全球癌癥首位[2]。雖然肺癌的診斷技術已不斷進步,治療方案逐步完善,但目前肺癌發病率和病死率仍在逐年上升。肺癌根據組織病理學分型可分為非小細胞肺癌 (non-samll cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌,其中約85%的肺癌是NSCLC[3]。NSCLC患者早期多無明顯癥狀,由于缺乏有效的篩查手段,被確診的NSCLC 患者多已經進展到晚期從而失去手術機會,5年生存率不足20%[4]。不像小細胞肺癌對化療較為敏感,晚期NSCLC一直缺乏具有顯著療效的治療方式,目前多是采取以化療、放療及靶向治療為基礎的綜合治療,而靶向治療因其一定的療效成為NSCLC 重要的治療方法。

肺癌的靶向治療主要代表藥物為表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑 (epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)和單克隆抗體 (貝伐珠單抗等)。研究發現,40%～80%的NSCLC 中表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor,EGFR)被過度激活和表達,其與細胞增殖、血管生成和細胞凋亡密切相關[3]。事實上,NSCLC多可檢測到EGFR 基因突變,突變多發生在18～21外顯子上[3]。而EGFRTKI能夠阻斷EGFR 下游信號通路,從而抑制肺癌的進展。循證醫學研究證實EGFR 突變的NSCLC患者通過EGFR-TKI治療可獲益。

組織學方法活檢是肺癌診斷的金標準,但由于其有創性,對于一些難以耐受侵入性操作獲得組織標本的患者,往往不能取到腫瘤組織進行檢測。液態活檢是一種以患者體液為檢測標本的非侵入性檢測手段,是通過敏感的檢測手段檢測腫瘤細胞釋放于體液中的標志物以獲取腫瘤信息。由于其取材方便、快捷且能夠動態監測腫瘤基因信息的特點,具有良好的發展前景。液態活檢主要檢測物包括循環腫瘤細胞、循環腫瘤DNA、長鏈非編碼RNA、小分子RNA、外泌體等。目前液態活檢已經廣泛應用于肺癌的EGFR 基因檢測,成為肺癌EGFR 基因檢測的有效手段之一[5-6]。

本項研究隨機選取了107例均已采用液態活檢進行血漿EGFR 基因檢測的晚期NSCLC患者,通過對其血漿EGFR 基因表達情況和臨床資料的比較,回顧性分析了EGFR 突變患者的臨床診療特點,以此指導EGFR 基因檢測在NSCLC患者中的臨床應用。

1 對象與方法

1.1 臨床資料 選取2012年1月至2017年12月上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院收治的經過EGFR 基因檢測的晚期 NSCLC 患者 107 例。EGFR 基因檢測樣本為血漿,檢測位點包括第18、19、20、21外顯子。晚期定義為根據2009年國際肺癌研究學會公布的第7版肺癌TNM 分期系統中初次確診為肺癌Ⅲ～Ⅳ期的患者 (Ⅲ期18例,Ⅳ期89 例)。患者中男 66 例,女 41 例；年齡(63.38±2.04)歲,年齡范圍為27～84歲。組織病理類型包括腺癌93例、鱗癌8例、腺鱗癌4例、鱗癌伴大細胞癌1例、肉瘤樣癌1例。本研究回顧性收集患者相關資料,對患者的診斷和治療沒有任何干預和影響,符合 《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2 治療隨訪 治療方式包括手術治療9例、化療83例、放療16例、靶向治療67例和免疫治療1例,其中有9例患者未行治療。隨訪開始時間為治療開始時間,隨訪終止時間為2017年12月31日。總生存期 (overall survival,OS)定義為治療開始至因任何原因導致死亡的時間,計算對象為在OS內僅通過藥物治療 (包括化療、靶向治療和免疫治療)的患者。無進展生存期 (progressive-free survival,PFS)定義為一線治療開始至疾病進展(包括出現遠處轉移、出現新發病灶和病灶增大達疾病進展水平)及任何原因導致死亡的時間,計算對象為在PFS內僅通過藥物治療 (包括化療、靶向治療和免疫治療)的患者。

1.3 EGFR 基因檢測方法 檢測樣品為血漿,按照人類血漿游離DNA 提取試劑盒 (上海允英醫療科技有限公司)說明書提取血漿內游離DNA,后按照人類EGFR 基因突變檢測試劑盒 (上海允英醫療科技有限公司)說明書通過實時熒光定量PCR方法檢測提取的DNA 樣本中EGFR 19-Dels、L858R、 T790M、 20-Ins、 G719A、 G719S、G719C、S768I、L861Q 突變。本組資料中有29例患者均進行了血漿和組織EGFR 檢測,兩者一致率為89.7%,血漿EGFR 檢測特異度84.2%,敏感度100%。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件進行χ2檢驗、logistic回歸分析、COX 回歸分析和生存分析,計數資料以例數 (百分比)表示,OS及PFS以月份數表示,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床特征分析 入組患者中EGFR 突變型63例,野生型44例,EGFR 突變率為58.9%。EGFR突變型中,外顯子18突變1例,外顯子19突變39例,外顯子20突變14例,外顯子21突變25例。患者中單個位點突變49例,多個位點突變14 例 (EGFR 18/21突變1例 ,19/21突變6例 ,19/20突變5例,20/21突變1例,19/20/21突變1例)。

入組患者中＞60歲70例,≤60歲37例；男66例,女41 例；有吸煙史47 例,無吸煙史60例；中央型肺癌30例,周圍型肺癌77例；腫瘤原發灶部位在右肺67例,左肺40例,肺上葉55例,肺下葉33例,肺門18例,肺中葉1例。患者中最常見首發癥狀為咳嗽、咳痰 (表1)。患者在病程中遠處轉移45例,其中多發遠處轉移23例,骨轉移43例,肝轉移18例,腦轉移30例,腎轉移3例,腎上腺轉移7例。

表1 107例晚期非小細胞肺癌患者首發臨床癥狀特點

2.1.1 EGFR 突變型和野生型患者臨床特征分析從年齡、性別、吸煙史、病理類型、影像學分型、腫瘤原發病灶部位、遠處轉移七個方面對EGFR 突變型和野生型進行比較分析發現,女性EGFR突變率與男性比較差異有統計學意義 (χ2=7.685,P=0.006)。而年齡、吸煙史、病理類型、影像學分型、腫瘤原發灶部位及遠處轉移在EGFR突變型和野生型比較中,差異均無統計學意義(P值均＞0.05),見表2。對性別因素進一步做logistics回歸分析,發現女性與EGFR 突變型具有顯著相關性 (OR=3.294,95%CI：1.393～7.79,P=0.007)。

2.1.2 EGFR 單個位點突變和多位點突變患者臨床特征分析 通過對單個位點突變和多位點突變的臨床特征比較分析可以發現,EGFR 單或多位點突變在年齡、性別、吸煙史、病理類型、影像學分型、腫瘤原發病灶部位比較中,差異均無統計學意義 (P值均＞0.05),見表2。在遠處轉移方面,是否發生肝轉移在單個位點和多位點突變患者中比較差異有統計學意義 (χ2=4.162,P=0.041),而在骨轉移和腦轉移中并非如此。采用logistic回歸分析對該因素進行分析可發現多位點突變與發生肝轉移無明顯相關性 (OR=3.981,95%CI：0.994～15.943,P=0.051)。

2.2 藥物治療預后及療效分析 本研究中化療83例,靶向治療67 例 (靶向治療藥物包括EGFRTKI和單克隆抗體,其中使用EGFR-TKI的有吉非替尼27 例、厄洛替尼22 例、埃克替尼11 例、阿法替尼4例、克唑替尼4例、阿帕替尼2例、奧希替尼2例,使用單克隆抗體為貝伐珠單抗23例),免疫治療1例 (伊匹木單抗)。病程中僅使用藥物治療的患者73例,其中僅使用化療26例,僅使用靶向治療11例,使用靶向+化療36例。一線治療僅使用藥物治療的患者86 例,其中僅使用化療47例,僅使用靶向治療18 例,使用靶向+化療21例。

表2 EGFR 突變狀態及突變位點數量患者的臨床特征比較分析 [例 (%)]

2.2.1 EGFR 是否突變對預后的影響 通過生存分析發現EGFR 突變型和野生型患者經藥物治療后OS比較差異無統計學意義 (χ2=3.526,P=0.060),但PFS 比較差異有統計學意義 (χ2=5.927,P=0.015),突變型較野生型PFS明顯延長 (HR=0.511,95%CI：0.288～0.905,P=0.021)。對于治療過程中僅使用化療的患者,EGFR 突變型和野生型的OS和PFS比較差異均無統計學意義 (χ2=0.002、2.228,P值均＞0.05)。

2.2.2 EGFR 突變位點數量對預后的影響 63例EGFR 突變型患者中,排除手術或放療的患者,僅使用藥物治療的患者共46例,55例一線治療僅使用藥物治療 (18例僅使用EGFR-TKI,23例僅使用化療,14 例使用化療+EGFR-TKI±貝伐珠單抗)。通過生存分析發現單個位點突變的患者較多位點突變OS顯著延長 (χ2=3.951,P=0.047),但突變位點數量并非為影響OS的獨立因素 (HR=7.158,95%CI：0.742～69.021,P=0.089)；突變位點數量對PFS并無顯著影響 (χ2=0.491,P=0.484)。對于一線治療僅使用化療 (χ2=0.039,P=0.843)或僅使用EGFR-TKI(χ2=0.936,P=0.333)治療的患者,EGFR 突變位點數量對PFS均無顯著影響。

2.2.3 EGFR 突變型患者EGFR-TKI的療效評價在僅使用藥物治療的EGFR 突變型患者中排除使用單克隆抗體 (貝伐珠單抗)的患者,29 例使用EGFR-TKI,9例僅使用化療,使用EGFR-TKI較僅使用化療的患者OS明顯延長 (χ2=11.493,P=0.001)。在使用EGFR-TKI患者中一線或一線聯合化療較一線僅使用化療OS顯著延長 (χ2=8.632,P=0.003)。EGFR-TKI作為二線或二線以上用藥患者的OS與僅使用化療的患者比較,差異無統計學意義 (χ2=2.896,P=0.089)；EGFR-TKI作為一線用藥或一線聯合化療用藥患者與二線或二線以上用藥患者OS比較,差異無統計學意義 (χ2=2.864,P=0.091)。

2.2.4 EGFR 野生型患者EGFR-TKI療效評價在44例EGFR 野生型患者中,排除經過手術或放療的患者,27例僅使用了藥物治療,一線治療均采用化療,其中排除7 例病程中使用單克隆抗體(貝伐珠單抗)及免疫治療 (伊匹木單抗)的患者,3例均使用EGFR-TKI作為一線聯合化療或二線、二線以上用藥,17例未使用EGFR-TKI,兩者OS比較,差異無統計學意義 (χ2=0.018,P=0.894)。

3 討論

目前肺癌仍是世界上最常見的癌癥,由于肺癌早期癥狀的隱匿性,診斷時多已處于中晚期,患者往往難以得到早期治療。近年來,靶向藥物尤其EGFR-TKI藥物的出現為晚期肺癌患者帶來了希望。EGFR 屬于ErbB受體家族,為受體酪氨酸激酶家族,能夠與配體結合以磷酸化的形式激活Ras/Raf/MAPK 等下游信號通路,促進細胞增殖及血管生成,抑制細胞凋亡[7]。EGFR 以基因突變、基因擴增、表達上調的形式在腫瘤細胞中被過度激活,從而可作為抗腫瘤的治療靶點。EGFR 突變多見于東亞、肺腺癌的患者中[8-10]。本組資料中,93 例腺癌患者有57 例 (61.3%)檢測到EGFR 突變,高于非腺癌患者的EGFR 突變率,但差異無統計學意義。此外,大量資料顯示EGFR突變更多見于女性、無吸煙史的患者中。Yang等[9]對315例NSCLC患者進行臨床分析,其中女性、非吸煙、腺癌的患者較可能發生EGFR 突變,EGFR 突變狀態還與癌胚抗原的表達水平正相關,當癌胚抗原≥20μg/L,尤其在20～49μg/L 時提示該患者EGFR 突變的可能性大。Shi等[10]對1 482例亞洲國家晚期NSCLC 患者的EGFR 突變狀態進行分析發現,EGFR 突變狀態與國家、性別、種族、吸煙狀態、吸煙時長、疾病分期均有關,EGFR 突變更多見于女性、無吸煙史或吸煙年限短、疾病分期越晚的腺癌患者中,但文獻也提示仍有超過50%的EGFR 突變陽性患者存在于男性或吸煙人群中。本組資料顯示,EGFR 突變更多見于晚期NSCLC女性患者中,非吸煙、腺癌患者的EGFR 突變率更高,但差異無統計學意義；EGFR突變狀態也與患者年齡、原發灶的部位、肺癌影像學分型和遠處轉移無明顯相關性。雖然EGFR 突變患者有著鮮明的臨床特征,但僅基于臨床特征進行EGFR 基因檢測是存在一定局限性的。

此外,本研究還探究了EGFR 多位點突變可能存在的臨床特點和對預后的影響,發現對于多位點突變的EGFR 突變型患者較單個位點突變更易發生肝轉移,且OS顯著縮短,提示預后較差。但多位點突變導致該臨床特點的背后原因還待進一步探討。

EGFR-TKI能夠阻斷酪氨酸激酶結構域與ATP相接處,從而阻斷下游通路的信號轉導[7]。目前常用的EGFR-TKI有吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼等。一項meta分析顯示相比使用一線化療,吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼的使用對EGFR 突變的肺癌患者緩解率明顯提高,PFS明顯延長 (中位PFS 9.6～13.1月比4.6～6.9月,HR=0.37,P＜0.001),患者的癥狀得到更有效的控制[11]。Maemondo等[12]選取日本230例已發生轉移EGFR 突變陽性的NSCLC患者給予紫杉醇+卡鉑化療或吉非替尼單藥治療,研究發現吉非替尼組相比標準化療組PFS顯著延長,吉非替尼組中位PFS可達10.8個月 (HR=0.3,95%CI：0.22～0.41,P＜0.001),而標準化療組中位PFS為5.4個月,同時吉非替尼組的緩解率也明顯高于化療組(73.7% 比30.7%,P＜0.001)。本組資料顯示突變型患者的PFS 顯著延長 (HR=0.511,95%CI：0.288～0.905,P=0.021),EGFR 突變型患者使用EGFR-TKI較僅使用化療的OS 明顯延長 (P=0.001),EGFR 野生型患者中EGFR-TKI作為一線聯合化療或二線、二線以上用藥與未使用EGFR-TKI的OS 比較,差異無統計學意義,且EGFR 突變狀態并不影響患者從化療中的獲益成都,可見EGFR 突變型患者使用EGFR-TKI可得到更多獲益。本組資料還顯示一線使用或一線聯合化療使用EGFR-TKI的EGFR突變型患者較僅使用化療OS 顯著延長 (P=0.003),EGFR-TKI作為二線或二線以上用藥的患者較僅使用化療OS 延長,但差異無統計學意義,表明一線使用或早期使用EGFR-TKI可有效延長患者OS。同時,有研究報道一線使用EGFRTKI也可顯著改善NSCLC患者的生存質量并延長PFS[12-13]。總而言之,對于EGFR 突變的NSCLC患者,建議一線使用或早期使用EGFR-TKI治療。

液態活檢作為一項有望代替組織活檢的新興病理檢測技術逐漸走入人們的視野。在這個提倡 “精準醫療”的時代,液態活檢憑借其方便快捷、無創性的特點為人們所青睞。液態活檢技術已成為肺癌EGFR 基因有效檢測技術之一。一項涉及13項研究的meta分析顯示2 349例晚期NSCLC 患者樣本中血液EGFR 基因檢測具有較高的特異度 (96%,95%CI：0.90～0.99)及敏感度(61%,95%CI：0.49 ～ 0.72)[14]。2017年公布的IGNITE研究顯示在2 581例NSCLC患者中血液檢測具有較高特異度,亞太地區患者中達到97.2%,血漿與組織的一致率為77.7%[15]。本研究選取的患者均使用液態活檢技術進行EGFR 基因檢測,29例均進行組織和血漿EGFR 基因檢測的患者中,血漿EGFR 基因檢測特異度為84.2%,敏感度為100%,與組織EGFR 基因檢測一致率可達89.7%。可見液態活檢技術在EGFR 基因檢測應用中有一定的可靠性。

綜上所述,EGFR 突變更多見于晚期NSCLC中的女性患者,與患者年齡、腫瘤原發灶的部位、影像學分型、遠處轉移無顯著相關性。多位點EGFR 突變的晚期NSCLC 患者更易發生肝轉移,預后較單個位點突變差。EGFR-TKI對EGFR 突變型晚期NSCLC患者有顯著療效,建議一線使用或早期使用EGFR-TKI治療。液態活檢可作為肺癌EGFR 基因檢測的有效手段之一。由于EGFR基因檢測仍存在一定的假陰性,了解EGFR 突變患者的臨床特征對于協助指導臨床用藥和個體化治療有著重要作用。如何制定有效的EGFR-TKI治療策略還需待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突