血液中脂肪細胞膜特異性蛋白ASC-1的來源探討

王卓 娜布其 張平驥 王艷勛 呂艷偉 安貴生

1北京積水潭醫院呼吸與危重癥醫學科 100035；2北京積水潭醫院臨床流行病學研究室 100035；3北京積水潭醫院創傷骨科 100035

脂肪栓塞 (fat embolization,FE)是血液循環外的脂肪成分進入血液循環的一種狀態,可以有或沒有臨床表現[1]。脂肪栓塞綜合征 (fat embolism syndrome,FES)是脂肪成分進入血液循環并導致一系列臨床癥狀和體征的臨床癥候群。FES是FE的嚴重后果[2-3]。由于FE缺乏敏感的診斷指標,使人們甚至不少醫務工作者誤認為FE 的發病率較低,其實FE 的發病率很高。FE 和FES好發于創傷、骨折、骨科手術、抽脂手術和自體脂肪移植手術后。創傷和長骨骨折患者中FE 的發病率高達90%[4-6],其中22.5%～29%的人發展為FES[7-8]。FE的病死率目前報道差異較大,可高達60%[9]。目前國內外臨床診斷FE 主要靠病理診斷,在血管中發現脂肪栓子即可確診。但此法多在患者死亡后才能應用,臨床價值明顯受限。FES的診斷標準來源于1974年Gurd和Wilson提出的框架[10]。后來,有學者在以上基礎上加入了一些新的診斷指標,如尿中發現脂肪滴、痰或支氣管肺泡灌洗液中發現脂肪滴等[11-13],但研究發現這些并非FE所特有。目前關于FE和FES的實驗室檢查仍缺乏特異性,診斷標準敏感度差,漏診率很高[14]。不少患者很難和創傷所致腦部損傷、肺部損傷等疾病相鑒別。近40年來,FE 和FES的診斷標準少有變化,診斷非常困難,導致了大量患者被誤診和漏診。因而尋找敏感度和特異度高的FE和FES診斷指標是世界范圍臨床工作的迫切需要。

造成FE的栓子來源主要有兩方面：黃骨髓中的脂肪細胞；皮下或臟器周圍的脂肪細胞。脂肪細胞中含有甘油三酯和膽固醇。正常情況下,人血循環中也存在甘油三酯、膽固醇及乳糜顆粒等成分,但不存在脂肪細胞膜成分。如果在血循環中發現脂肪細胞膜成分,說明循環外的脂肪成分進入血循環,就可證明FE的發生。如果能找到脂肪細胞膜特異的標志物,當FE發生時,只要在外周血中檢測到這種特異的標志物就可以證實FE 的發生。因此筆者提出從分子水平對FE 進行診斷的思路。為了證實以上假設,筆者選擇人脂肪細胞膜特異性蛋白ASC-1作為研究切入點。本實驗需要證實ASC-1廣泛存在于脂肪組織和黃骨髓中,而不存在或極少存在于正常人外周血中。如果ASC-1被證實具備這一特點,在骨折或骨科手術后的患者外周血中發現ASC-1,就可以說明發生了FE。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究共納入來自北京積水潭醫院的30例受試者,其中4例非手術患者,26例手術患者；男9 例,女21 例；年齡范圍為46～84歲；身高范圍為148～180 cm；體質量范圍為50～88 kg。本研究經北京積水潭醫院倫理委員會批準(積倫科審字第201811-08號-備01號)。研究遵循的程序符合北京積水潭醫院倫理委員會所制訂的倫理學標準。所有納入者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標本收集 取6例預行髖關節置換術或膝關節置換術患者 (既往無外傷史及手術史)術前全血各3 ml,取4例非手術患者 (既往無外傷史及手術史)入院時全血各3 ml,取10例行髖關節置換術或膝關節置換術患者術后24 h全血各3 ml。不抗凝,室溫血液自然凝固10～20 min,1300×g離心10 min。取分離出的血清凍存于-80 ℃冰箱,備用。取10例行髖關節置換術或膝關節置換術患者術中廢棄的黃骨髓各1 ml,皮下脂肪或關節腔內脂肪各1 cm3,凍存于-80 ℃冰箱,備用。

1.2.2 脂肪和黃骨髓的處理 切割標本后,稱取重量100 mg。剪成小塊,用1 ml PBS洗滌2次,500×g離心5 min,小心棄上清。向組織樣品中加入1 ml總蛋白提取緩沖液 (北京全式金生物技術有限公司),振蕩混勻,將組織懸液轉移至預冷的玻璃勻漿器中,勻漿6～10次。將勻漿后的組織懸液轉移至一個新的1.5 ml離心管中,冰上孵育30 min,期間每 10 分鐘振蕩混勻1 次。4 ℃,1400×g離心10 min。小心收集上清 (細胞總蛋白)于-80 ℃保存,或直接進行后續實驗。

1.2.3 標本融化后仍然保持2～8℃的溫度。加入一定量的PBS (p H 7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。1300×g離心20 min。仔細收集上清。分裝后1份待檢測,其余冷凍備用。共收集40份標本,其中血清20份 (術前10份,術后24 h 10份),黃骨髓10份,下肢皮下脂肪組織5份,膝或髖關節腔內脂肪5份。

1.2.4 ASC-1 的檢測 采用美國Andy Gene Biotechnology公司生產的人ASC-1酶聯免疫吸附實驗試劑盒。按說明書操作。該試劑盒檢測范圍：30～1 200 ng/L。

1.3 統計學分析 本研究采用前瞻性對照研究,存在自身對照和組間對照。因病例較少,ASC-1的濃度不符合正態分布,以M (QR)來描述。

2 結果

2.1 患者一般情況 本研究共納入30例受試者,標本共40份。術前患者中有2例老年女性膝關節骨性關節炎患者血清檢測到ASC-1,1例經再次詢問病史,發現其術前接受過小針刀治療和關節鏡檢查,1例術前接受過按摩治療。術后患者中有3例血清檢測到ASC-1,1例為單側全髖置換術后,2例為單側全膝關節置換術后。這3例患者術后病情穩定,未發現明顯不適,除手術傷口附近以外,未發現皮膚散在瘀點和瘀斑,均于術后24 h出現血WBC升高,中性粒細胞比例升高,血紅蛋白水平降低,血小板水平降低,術后2～3 d的低熱。術后3～4 d出院,院外隨診未發現異常。其余7例術后患者也出現了血WBC 升高,中性粒細胞比例升高,血紅蛋白水平降低,血小板水平降低,術后2～3 d低熱的情況。6號標本 (術前)和11號標本 (術后)來自同一男性患者,血清中均未測出ASC-1。5號標本 (術前)和16號標本 (術后)來自同一女性患者,血清中均測出ASC-1,且術后高于術前水平。7號標本 (術前)和12 號標本 (術后)來自同一女性患者,血清中均測出ASC-1,但術后低于術前水平。見表1。

2.2 不同標本來源的ASC-1濃度 非手術患者血清中未檢測到ASC-1,下肢皮下脂肪5例均檢測到ASC-1,5例患者關節腔內脂肪組織的均漿液中4例未檢測到ASC-1,1 例檢測到ASC-1,水平較低。共取下肢長骨內黃骨髓10 例,5 例檢測到ASC-1 (表2)。

表2 不同標本來源的ASC-1濃度 (ng/L)

3 討論

目前,國內外對于FE 的診斷主要依賴對肺、腦、腎等部位的病理學檢查發現小血管中存在脂肪栓子。但此法多用于患者死亡后的尸體解剖,故大大限制了應用。脂肪栓子不同于血栓栓子,脂肪栓子微小且分散,多以脂肪滴形式存在于血循環中,或嵌頓在小的血管中,故影像學檢查無論是CT、MRI幾乎沒有特異性改變[15]。實驗室檢查中的痰、支氣管肺泡灌洗液和尿中發現脂肪滴和血中巨脂肪球也不具有特異性,在非FE 患者中也常見到[11,16]。因為正常情況下,人血循環中也存在甘油三酯、膽固醇及乳糜顆粒等成分。目前,尚無易操作、特異且敏感的FE診斷方法。

關于FES的診斷方法,臨床普遍采用1974年Gurd和 Wilson[10]提出的FES 診斷標準。診斷須有損傷和潛伏期,且滿足至少1條主要條件和至少4條次要條件。主要條件：呼吸功能不全；腦功能障礙；瘀血點。次要條件：發熱；心動過速；視網膜改變；黃疸；腎功能異常 (包括少尿、無尿、血尿)；貧血；血小板減少；ESR 加快；血中發現巨脂肪球。該標準主要依靠臨床表現,實驗室檢查的各項指標均缺乏特異性,漏診率很高。不少患者很難和創傷所致腦部損傷、肺部損傷等疾病相鑒別。有些學者對FES的診斷進行了改良[17-19],另一些學者對高危患者進行評分,以此確定FES的診斷,但都因缺乏特異性和有效性,限制了臨床應用[20]。

造成FE的栓子來源主要有兩方面：(1)骨髓來源。骨髓存在于骨松質腔隙和長骨骨髓腔內,由多種類型的細胞和網狀結締組織構成,根據其結構不同分為紅骨髓和黃骨髓。幼兒的骨髓腔內全部為紅骨髓,5歲以后長骨內的紅骨髓,逐漸被脂肪組織所代替,成為黃骨髓。至18歲以后,全身長骨骨干幾乎充滿了黃骨髓。紅骨髓分布在扁骨 (顱骨、胸骨、肋骨、髂骨),椎骨,鎖骨,肩胛骨以及長骨的骺的骨松質中。黃骨髓主要由脂肪組織構成,即骨髓的基質細胞大量變為脂肪細胞,僅有少量幼稚細胞團,其造血功能微弱。當長骨骨折發生時,骨髓腔內的脂肪細胞受到擠壓和破壞,經破損的血管進入血循環,FE 隨即發生。髖關節、膝關節等置換術時,為了固定人工關節,關節假體的一端需要牢牢地嵌入骨髓腔內。嵌入并固定的過程中,骨髓腔內壓力很大,非常容易將骨髓腔內的黃骨髓,也就是脂肪細胞壓碎,擠進血管,進入血循環,FE隨即發生。所以,骨髓腔內黃骨髓中的脂肪細胞是FE栓子的主要來源。因此長骨骨折、關節置換術患者是FE的高危人群。(2)皮下或臟器周圍脂肪細胞來源。當創傷發生時,軟組織受到擠壓和破壞,破碎的脂肪細胞會被擠進受損的血管,進入血循環,導致FE。脂肪移植手術時,當向目標部位注射脂肪細胞時,為了達到美容效果,局部壓力或張力往往較高,會導致脂肪細胞進入血管,造成FE。所以皮下或臟器周圍脂肪細胞是FE 栓子的另一主要來源。創傷及脂肪移植術患者也是FE的高危人群。

2014年,哈佛醫學院的Ussar等[21]學者確定了人脂肪細胞膜特異性蛋白ASC-1,該研究論文發表在影響因子為16.79的 《Science Translational Medicine》上。ASC-1蛋白在其他細胞和組織中很少表達,尚未檢索到在血液中表達的報道。以上的研究成果為從分子水平對FE 進行診斷奠定了基礎。故筆者提出假設：如果在人的外周血液中檢測到脂肪細胞膜特異性蛋白,說明存在FE。FE的栓子微小且分散,多以脂肪滴形式存在于血循環中。FE發生時,較小碎片可以通過肺循環到達體循環[15-16],故推測在外周血中可以檢測到脂肪細胞膜特異性蛋白ASC-1,當該蛋白在血中的含量高到一定水平時,即可發生FES。該假設如能被證實,只需取患者少量外周血進行檢測即可進行診斷。其結果可以用于FES與腦部損傷、肺部損傷的鑒別,應用前景廣闊。

Ussar等[21]學者發現ASC-1 在人的皮下、頸動脈鞘、頸長肌的脂肪細胞中含量很高。但他們未對人黃骨髓脂肪細胞中ASC-1的表達情況進行研究。筆者尚未檢索到在正常人血中檢測到ASC-1的報道。也未檢索到將ASC-1作為FE診斷指標的研究。為了證實筆者提出的假設,首先需證實人皮下脂肪細胞和骨髓腔內脂肪細胞中存在上述蛋白,然后需證實正常人外周血中無上述蛋白或僅有微量存在。如果在骨折患者外周血和/或關節置換術后患者外周血中檢測到上述蛋白,且含量顯著高于正常人血中含量,即可證明FE 的存在。上述蛋白濃度高到一定程度,可能發生FES。為此,筆者在少量受試者中進行了初步的探索。本研究結果顯示：(1)非手術患者 (內科患者)血清中和絕大部分擇期關節置換術患者術前血清中未檢測到ASC-1。(2)擇期關節置換術患者術前有2例血清中檢測到ASC-1,均為膝關節骨性關節炎老年女性患者,病史均為10年。其中1例ASC-1水平較高者,入院前接受過小針刀、關節鏡等檢查和治療,推測這些有創性的操作可能會導致ASC-1水平的升高。另1例ASC-1水平為58.0 ng/L,稍高于檢測下限。該患者未發現入院前接受過有創操作,但接受過推拿按摩,ASC-1 水平高于檢測下限原因尚需探究。(3)10例患者人工關節置換術后24 h的血清中有3例檢測到ASC-1。其中最高的1例為全髖關節置換術患者,另2例為全膝關節置換術患者。推測這是由于髖關節置換術對骨髓腔的影響比膝關節置換術的影響大,導致更多脂肪細胞受到破壞,進而更多的ASC-1蛋白進入血循環。3例患者術后除傷口疼痛以外,沒有明顯不適主訴。術后24 h血常規檢測均發現WBC 升高,血小板降低,血紅蛋白降低。體溫于術后有1～3 d的低熱,均于手術后3～4 d出院。出院后的隨診,未見明顯異常。推測這3例患者很有可能發生了無癥狀FE。(4)5例患者皮下脂肪組織的均漿液中,均檢測到ASC-1的存在,證實了在人腿部皮下脂肪中存在ASC-1。(5)5例患者關節腔內脂肪組織的均漿液中,1例檢測到ASC-1的存在,但濃度較低。關節腔中的脂肪組織是否有異于皮下脂肪,需進一步研究。(6)取自下肢長骨的10例黃骨髓中,5例檢測到了ASC-1 的存在,另5 例未檢測到ASC-1。黃骨髓的獲取時多數都混入血液,此因素可能會影響到ASC-1的水平。黃骨髓中ASC-1的表達情況,還需進一步研究。(7)有3例患者為術前、術后自身對照,出現了3種情況,即術前術后均未測出、術后水平高于術前、術后水平低于術前。因為例數太少,需要擴大例數以減少實驗偏倚。

本研究在部分患者外周血中檢測到了脂肪細胞膜特異性蛋白ASC-1。研究納入的手術患者均為擇期關節置換術患者,近2年內未發生骨折。手術過程中需要將人工關節假體嵌入并固定于骨髓腔,非常容易將骨髓腔內的黃骨髓,也就是脂肪細胞壓碎,擠進血管,進入血循環。故推測ASC-1主要來源為骨髓腔內脂肪細胞。手術中需要切開皮膚及皮下脂肪等組織進入關節腔,并切除多余的關節腔內脂肪組織。安裝人工關節時,對周圍皮下脂肪會有擠壓,故推測皮下脂肪細胞是血中ASC-1的次要來源。關節腔內脂肪細胞來源可能性很小。3例術后血中檢測到ASC-1的患者沒有明顯的不適主訴,不符合1974年FES診斷標準,但不能排除他們發生了無臨床癥狀的FE。

本研究的優點是提出了從分子水平對FE 進行診斷的新思路,為尋找敏感、特異的FE 診斷指標提供了可能。缺點是因既往無相關研究,本研究為初期探索試驗,例數少,并非所有納入患者均為自身對照。支持本研究假設的結果是：非手術的患者血清中均未檢測到ASC-1,術前患者大部分未檢測到ASC-1；皮下脂肪中均檢測到ASC-1；黃骨髓中也檢測到ASC-1。不支持的結果是：關節腔內脂肪幾乎都未測出ASC-1；自身對照患者術后血清中的ASC-1濃度并非都高于術前。本研究所用試劑盒的監測范圍在30～1 200 ng/L,可能會影響含量較低樣本的檢測結果。由于臨床中發生的FE 如果沒有明顯癥狀,往往被漏診。有明顯癥狀的根據上述1974年診斷標準,疑診或確診為FES。本研究中納入者中,雖然沒有滿足1974年FES診斷標準的患者,但很有可能存在FE 患者,因為我們發現了術后SAC-1水平高于術前的患者。

綜上所述,本研究為從分子水平對FE 進行診斷提供了初期研究資料。脂肪細胞膜特異性蛋白ASC-1可能成為FE診斷的特異性指標,但需進一步研究以證實其臨床應用價值。未來筆者將從擴大樣本量、加強自身對照、提高試劑盒敏感度、尋找其他脂肪細胞或脂肪組織特異性標志物等方面來開展進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

致謝感謝北京積水潭醫院矯形骨科褚亞明醫師、姜旭醫師、呂明醫師、唐竟醫師,檢驗科邱爽醫師,腎內科楊潔醫師、王曉飛醫師、陳天怡醫師,呼吸與危重癥醫學科戴麗醫師、王艷醫師、徐志新護士對本研究的幫助和支持