結核感染T細胞γ干擾素釋放實驗的不確定結果分析

杜利君，張 兵，李 欣，楊 波，邢 晏

(1.南充市中心醫院/川北醫學院第二臨床學院檢驗科，四川南充 637000；2.西華師范大學數學與信息學院,四川南充 637000)

結核病是一種由結核分枝桿菌(MTB)感染引起的傳染病，嚴重危害著人類的生命健康。根據世界衛生組織(WHO)2017年全球結核病報告顯示，2016年全球結核病發病的人數為1 040萬,中國是全球30個結核病高負擔國家之一[1]。此外，在我國甲、乙類傳染病病死率中，肺結核排名第2位，其實驗室診斷率不足40%[2]。由于結核病的診斷較為復雜，既往的細菌病原體檢測、結核菌素皮膚試驗(TST)、抗結核抗體檢測及影像學檢查等診斷方法遠遠不能滿足臨床需求[3]。經過不斷地研究，以T淋巴細胞免疫為基礎的體外γ-干擾素釋放試驗(IGRAs) 近年來在臨床得到廣泛應用。IGRAs檢測的基本原理是MTB特異性抗原-早期分泌抗原6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)在體外刺激全血中的T淋巴細胞產生γ干擾素(IFN-γ)，通過酶聯免疫吸附測定實驗法(ELISA)測定 IFN-γ水平來判斷受檢者是否感染MTB。雖然IGRAs已成為國內外結核診療指南推薦的重要實驗室檢測方法[4-5]，是臨床診斷結核病的重要輔助手段，但在檢測過程中，除了有陰性結果、陽性結果外，還會產生一定比例的不確定結果(ITRs)[6]。不確定結果不能反映患者的結核感染狀況，可能引起臨床醫生診斷MTB感染的混亂及正確解釋IGRAs不確定結果的困難；此外，在檢測過程中一旦遇到不確定結果，實驗室將重新采集標本復查，延誤報告時間及增加檢測成本。因此，本文通過回顧2014年7月至2018年7月在本院檢測的可疑結核感染患者或需排除結核感染患者的IGRAs，分析不確定結果發生的比率及原因，為臨床了解IGRAs不確定結果可能發生的疾病因素及正確解釋IGRAs不確定結果報告提供依據和思路，同時為優化試劑盒性能、提高IGRAs檢測的可靠性和準確性奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧2014年7月至2018年7月在本院1 781例可疑結核感染患者或需排除結核感染患者的IGRAs檢測結果，年齡為(48.23±19.84)歲，其中男1 139例，女642例。按不同年齡分為3組，<18歲組163例，18～65歲組1 100例，≥65歲組518例。

1.2 儀器與試劑 IGRAs試劑盒(北京萬泰生物藥業股份有限公司)，恒溫培養箱(上海博迅公司)，Mutiskan FC酶聯免疫檢測儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 IGRAs試驗 嚴格按照試劑盒說明書操作。采集4 mL肝素鋰抗凝靜脈全血，2 h之內送至實驗室。按每管1 mL全血分裝至本底對照培養管(N管)、測試培養管(T管) 、陽性對照培養管(P管)，輕柔顛倒混勻5次后，將培養管直立于37 ℃恒溫箱中，溫育22～24 h。將培養后的培養管以3 000 r/min，離心10 min，通過ELISA檢測上清液中的γ-干擾素(IFN-γ)水平，酶標儀在波長450 nm處測定其吸光度A，根據試劑盒中校準品制作標準曲線，計算IFN-γ水平。

1.3.2 實驗室質量控制 由6個標準液的吸光度A值與相應濃度計算得出的相關系數(r)≥0.99； 400 pg/mL的標準液的平均吸光度A值<1.0。

1.3.3 判斷標準 所得不確定結果均需重新采集樣本復查，以排除實驗因素引起不確定結果，復查后仍為不確定，則判定為不確定結果，見表1。

表1 IGRAs檢測結果的判定標準(pg/mL)

注：n=本底對照培養管(N管)、T=測試培養管(T管)、P=陽性對照培養管(P管)

1.4 統計學處理 回顧2014年7月至2018年7月例患者的IGRAs檢測結果，用Excel 2007軟件建立數據庫，用SPSS22.0軟件進行統計分析。計數資料用百分率表示，組間比較用χ2檢驗，采用二元Logistic回歸進行單因素與不確定結果的分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 IGRAs的檢測結果 1 781例IGRAs檢測樣本，陽性569例(31.95%)，陰性1 151例(64.63%)，不確定結果61例(3.43%)。

2.2 不同性別患者IGRAs的檢測結果比較 1 781例IGRAs檢測樣本中，男性1 139例，女性642例，男性陽性率為33.45%，女性陽性率為29.28%，差異無統計學意義(χ2=3.208，P=0.075)；男、女患者ITRs分別為3.34%，3.58%，差異無統計學意義(χ2=0.073，P=0.784)，見表2。

表2 不同性別患者IGRAs的檢測結果比較[n(%)]

2.3 不同年齡組的IGRAs的檢測結果比較 1 781例IGRAs檢測樣本中，<18歲組的患者IGRAs陽性率明顯低于18～65歲組和≥65歲組，差異有統計學意義(χ2=28.448,P=0.000)；與18～65歲組比較，<18歲組和≥65歲組ITRs發生率較高，差異均有統計學意義(χ2值分別為10.584、9.015；P=0.001、0.003)。<18歲組和≥65歲組ITRs發生率比較，差異無統計學意義(χ2=0.722，P=0.396)，見表3。

表3 不同年齡組的IGRAs的檢測結果比較[n(%)]

2.4 檢測IGRAs的確診疾病類型與ITRs的關系 對61例可疑結核感染患者IGRAs的ITRs標本進行回訪，剔除4例資料不全患者，經二元logistic回歸分析，自身免疫性疾病(OR為2.84;95%CI為1.50～5.39;P=0.001)、HIV感染患者(OR為3.04;95%CI為 1.26～7.35;P=0.013)的ITRs與確定結果(陰性/陽性)差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 檢測IGRAs的確診疾病類型與ITRs的關系

注：與陰性/陽性確定結果比較，*P<0.05

3 討 論

目前，大量研究評估了IGRAs在疑似結核病患者診斷中的臨床應用價值[7-8]，而較少研究IGRAs檢測中出現的不確定結果。DIEL等[9]研究顯示，IGRAs的不確定結果發生率在3%～21%，不確定的結果可能限制IGRAs使用的有效性，影響結核病的診斷和治療。因此，除了關注IGRAs檢測的陰性或陽性結果之外，還應重視IGRAs不確定結果發生的比例和原因，為臨床疾病的診斷和治療提供幫助。

本研究顯示臨床懷疑或者需排除結核感染的患者檢測IGRAs的不確定結果發生率為3.43%，與TEBRUEGGE等[10]研究基本一致，不確定結果主要在患有慢性疾病如風濕性疾病[11]或免疫功能低下[12]的患者中出現，而產生不確定結果的潛在性因素可能主要是由于陽性對照管弱應答植物血凝素(PHA)的刺激，產生低水平的IFN-γ；或者少量患者出現無PHA刺激的本底對照管的高水平IFN-γ背景[13-14]。本研究顯示，不確定結果在<18歲組與≥65歲組發生率較高，而在18～65歲組較低，提示免疫功能是否完善在IGRAs的不確定結果發生中具有重要作用，兒童青少年免疫功能尚處在發育階段，老年人免疫功能逐漸衰老，年齡可能是PHA誘導IFN-γ應答高低的關鍵因素，使用年齡特異性的陽性對照截斷值，或摻入另一種產生相似的陽性對照刺激物，可能提高IGRAs試劑盒在兒童青少年和老年人群中的檢測性能，降低不確定結果的發生率[10]。此外，本文未發現性別與IGRAs的不確定結果發生率的差異，在關于性別與不確定結果的關系研究中，研究的結論并不一致，BEFFA等[15]通過對1 429例患者如有結核接觸史、或TST(+)、或結核病、或可疑結核患者進行分析，認為性別與不確定結果的發生無關；而JUNG等[16]通過對631例風濕疾病患者的研究，發現女性與IGRAs不確定結果發生更為密切，性別與不確定結果關系研究結論不一致可能與納入研究對象的疾病類型、樣本數量、種族、地理來源、卡介苗接種史和伴隨免疫抑制劑的標準治療使用有著密切的關系[17]。

免疫功能低下或機體長期處于慢性炎癥的作用下，可能增加活動性結核病的發病風險[18]，患者的IGRAs不確定結果與免疫功能低下和慢性炎癥密切相關[19-20]。因此，進一步回顧分析了1 781例患者的疾病種類，以判斷不確定結果發生的危險因素，結果顯示自身免疫性疾病、HIV感染患者的不確定結果與確定結果(陰性/陽性)差異有統計學意義(P<0.05)，提示不確定結果的發生可能與自身免疫性疾病、HIV感染患者關系密切。在自身免疫性疾病的發病機制中，發揮關鍵作用的TH17炎癥通路下調了由Th1途徑產生的IFN-γ水平，此外，在治療過程中使用免疫抑制劑、導致免疫功能低下、使全血中的T淋巴細胞體外低應答PHA的刺激，陽性對照管產生較低水平的IFN-γ[20]。 HIV感染患者不確定結果的發生可能與HIV病毒感染攻擊CD4+T細胞，使T細胞功能喪失，導致低應答PHA刺激有關，值得注意的是，在中晚期免疫缺陷患者中，不確定的IGRAs結果將增加嚴重臨床事件發生的風險。此外，研究者未發現不確定結果與慢性炎癥組的關系，可能與本次研究納入的樣本量較小有關。

本研究屬于回顧性研究，存在一定的局限性。未評估不確定結果與臨床免疫抑制劑的使用情況，與反映免疫功能的實驗室指標的關系，如淋巴細胞數量、清蛋白水平、CD4+細胞計數等，以及未評估其他可能影響不確定結果的檢測因素，如標本采集及處理時間、標本送檢的季節和溫度，及技術錯誤等。

綜上所述，通過回顧分析本院檢測的可疑結核感染患者或需排除結核感染患者IGRAs的不確定結果發生的比率及原因，發現不確定結果發生不僅與年齡因素關系密切，還與患者的免疫功能狀態或免疫抑制劑的使用密切相關。