早發型重度子癇前期患者血清2-ME水平和胎盤COMT表達及其意義

黃麗瓊，鄭 波△，張元珍

(1.咸寧市中心醫院湖北科技學院附屬第一醫院婦產科，湖北咸寧 437000； 2.武漢大學中南醫院婦產科，湖北武漢 430071)

子癇前期(子癇前期)是妊娠期特有的多器官多系統疾病，母兒并發癥多，病死率高，其發病機制至今仍未明確，目前采用的治療方式仍然是終止妊娠。2-甲氧雌二醇(2-ME)是17β雌二醇經細胞色素P450(CYP450)羥基化然后由COMT甲基化生成的代謝產物。2008年KANASAKI等[1]首次發現子癇前期患者體內2-ME水平降低，敲除COMT基因的小鼠可出現子癇前期癥狀，并能通過補充2-ME得以改善。雖然此后，不斷有學者進行2-ME/COMT與子癇前期關系的研究[2-4],但有關早發型子癇前期的研究罕見，而且COMT與子癇前期關系結論也不一致[5-6]。本課題組在前期實驗中發現晚發型子癇前期患者血清2-ME水平升高，胎盤COMT蛋白表達無明顯變化[7]。這一結論在早發型子癇前期患者中是否一致？為此設計此項研究來探討2-M/COMT與早發型重度子癇前期的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 子癇前期的劃分標準按照中華醫學會頒發的《妊娠期高血壓疾病診治指南(2012版)》執行，收集25例2014年3月至2017年3月期間咸寧市中心醫院婦產科收治的早發型重度子癇前期病例(孕周為28～34周，EOSPE組)，隨機選取同期健康對照組(NP組)25例，標準為孕周小于34周早產的單胎健康孕婦。收集包括孕婦年齡、孕產次、分娩孕周、體質量指數(BMI)、期待治療時間、收縮壓和舒張壓的臨床基本資料。研究已得到入組的健康孕婦與子癇患者的同意并簽署知情同意書，且課題研究通過咸寧市中心醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 血清2-ME水平檢測 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清2-ME水平。乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集兩組患者外周肘靜脈血10 mL，室溫直立靜置半小時后，以1 000 r/min離心15 min吸取上層血清樣本，-80 ℃超低溫保存待用。根據2-ME ELISA試劑盒(潤裕生物，上海)說明書同批次檢測血清2-ME水平，保證批差異小于5%。

1.3 胎盤COMT表達 分娩后10 min內，無菌狀態下以無菌剪刀剪取2塊約1 cm×1 cm×1 cm大小的胎盤絨毛膜組織，取材時注意避開胎盤中央母體面的出血、壞死或鈣化的區域。并立即用PBS磷酸緩沖液(PH 7.2)漂洗組織標本2次。其中一塊組織樣本以石蠟包埋處理，以用于后期免疫組化(IHC)檢測COMT表達；另一塊直接液氮冷凍保存，用于提取mRNA與蛋白樣本。注意給標本進行編號區分。

1.3.1 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測胎盤中COMT mRNA 按Trizol說明書提取總RNA，反轉錄合成cDNA，再使用實時熒光定量PCR儀(ABI7300型),引物見表1，進行PCR擴增，采用2-△△Ct法對結果進行分析。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參。

1.3.2 胎盤COMT蛋白檢測方法

1.3.2.1 免疫組化檢測 胎盤組織塊脫蠟后，滴加1%雙氧水(H2O2)5%牛血清白蛋白封閉液，室溫10 min。抗原修復后封閉30 min，加一抗4 ℃過夜，加二抗孵育30 min，DAB染色液顯色蘇木精復染，蒸餾水沖洗切片后，按病理標本處理標準進行乙醇梯度脫水后，以二甲苯透明切片，并用中性樹脂進行永久封片后，置于光學顯微鏡下觀察胎盤組織COMT蛋白免疫染色，定義將細胞質與/或細胞核染成棕黃色顆粒物為陽性染色。

1.3.2.2 采用蛋白質印跡法(Western Blot)法 取適量的胎盤組織塊，蛋白提取液，待組織充分裂解后，采用BCA試劑盒進行蛋白定量。每泳道上樣50 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白電泳后以PVDF膜進行轉膜45～60 min，轉膜結束后5%脫脂奶粉封閉膜1 h，將相應COMT一抗按1∶1 000稀釋后，4 ℃孵育PVDF膜過夜，PBS緩沖液沖洗膜后，帶辣根過氧化物酶標記的二抗(稀釋1∶2 000)孵育1～2 h，PBS緩沖液沖洗膜后，在膜上滴加幾滴ECL化學發光底物，放入凝膠成像系統進行曝光顯影，采用相應內參灰度值作為對照，對蛋白條帶進行相對定量分析。

表1 RT-PCR引物及序列

2 結 果

2.1 研究對象的臨床資料 兩組患者年齡、孕產次、孕周、孕前BMI比較差異均無統計學意義(P>0.05)，提示研究背景一致性；采血日BMI、收縮壓、舒張壓兩兩比較，差異有統計學意義(P<0.05)。分娩孕周、期待治療時間在EOSPE組和NP組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.2 兩組血清2-ME水平比較 EOSPE組孕婦血清2-ME水平為(525.3±172.6)pg/mL，NP組孕婦血清2-ME水平為(705.9±157.4)pg/mL，差異有統計學意義(P<0.05),見表2，提示早發型重度子癇前期孕婦血清中2-ME水平比健康孕婦降低。

表2 兩組孕婦臨床資料比較

注：與NP組比較，*P<0.05

2.3 兩組胎盤COMT的表達比較

2.3.1 RT-PCR法檢測胎盤COMT mRNA的表達水平 EOSPE組孕婦胎盤組織中COMT mRNA相對表達量為(0.447±0.152)，NP組孕婦胎盤組織中COMT mRNA相對表達量為(0.467±0.151)，差異無統計學意義(P=0.678)。

2.3.2 免疫組化檢測胎盤COMT蛋白表達 兩組孕婦胎盤組織中均有COMT表達，COMT表達定位在合體滋養細胞，見圖1箭頭所指，表達結果均為陽性。

注：A為NP組，B為EOSPE組

圖1 免疫組化檢測兩組胎盤COMT的表達情況(×200)

2.3.3 Western Blot檢測胎盤COMT的表達 COMT有兩種蛋白亞型，根據蛋白定位分為胞漿型(S-COMT)和膜結合型(MB-COMT)，胎盤COMT活性以S-COMT為主。EOSPE組孕婦胎盤組織中COMT蛋白相對表達量(0.891 6±0.102 0)，NP組孕婦胎盤組織中COMT蛋白相對表達量(0.924 0±0.158 7)，差異無統計學意義(P=0.422)，見圖2。

圖2 兩組孕婦胎盤組織中COMT蛋白相對表達量

2.4 EOSPE組血清2-ME與臨床資料的相關性分析 EOSPE組血清2-ME與臨床指標進行相關性分析并做出散點圖，其中EOSPE組2-ME水平與收縮壓是呈負相關(r=-0.648，P<0.05)；與期待治療時間呈正相關(r=0.694，P<0.05)。見表3、圖3、4。

圖3 血清2-ME與收縮壓相關性散點圖

圖4 血清2-ME與期待治療時間相關性散點圖

3 討 論

子癇前期是嚴重危害母嬰健康的妊娠期并發癥。世界衛生組織(WHO)年報顯示，全世界每年大約有1 500萬例早產兒，其中約有20%與子癇前期有關[8-9]。在經濟欠發達國家，子癇前期發病率和因子癇前期導致的孕婦病死率和新生兒早產率是經濟發達國家的20倍以上[10]。早發型子癇前期的發病早，母體病情發展迅速，疾病的進展期也不容易預判，且并發癥重，目前臨床的最佳治療方法就是適時終止妊娠。因此能夠預測病情發展，恰當的延長孕周，選擇最佳的終止妊娠時機，對改善孕婦和胎兒的不良結局有著關鍵作用。

2-ME是17β雌二醇在體內經COMT甲基化的生物活性代謝產物。曾有國外學者研究發現，重度子癇前期孕婦血清2-ME水平(982 pg/mL，3 nmol/L)，與輕度子癇前期(1 813 pg/mL，6 nmol/L)和正常足月孕婦(2 186 pg/mL，7 nmol/L)比較明顯降低，這與本研究結論基本一致[11]。此外，還有研究發現：在孕11～14周，血清2-ME水平低的孕婦(1.9×2 pg/mL，0.006 nmol/L)比健康孕婦(61.7×27 pg/mL，0.204 nmol/L)更容易發展為子癇前期[5]。上述數據表明，妊娠早期血清2-ME水平低可能與妊娠后期發展為子癇前期有關。LEE等研究者[12]發現在2.5%的低氧環境下，2-ME能誘導胎盤滋養細胞分化成侵襲表型，從而更有效地促使細胞浸潤生長。滋養層細胞成功入侵，其中低氧環境是重要因素之一，但并非是唯一的因素。2-ME可以通過保護母體血管功能、誘導滋養細胞侵襲表型分化、維持胎盤滋養細胞正常浸潤生長，從而達到預防子癇前期發生。本研究發現，EOSPE組患者血清2-ME水平和收縮壓呈負相關(r=-0.648，P<0.05)，但NP組中血清2-ME水平和收縮壓未發現具有相關性。雖然EOSPE組患者血清2-ME水平低，與病情程度具有一定的相關性，而且有證據證明2-ME可以抑制心血管平滑肌收縮、生長，防止血管動脈粥樣硬化并維持心血管功能有相當大的作用[13]，還有實驗發現2-ME能防止鼠大動脈平滑肌收縮[14]。以上證據均顯示2-ME通過對心血管平滑肌抑制、對內皮細胞功能影響，幫助孕婦維持心血管功能和血壓穩定。

在保證子癇前期孕婦和圍產兒安全的前提下，對無嚴重并發癥的早發型重度子癇前期緩和采取保守治療(又稱期待療法)，可適當延長孕周，減少因胎兒不成熟而致圍產兒死亡，降低患者嚴重并發癥發生概率。保守治療需要對患者和胎兒的嚴密監護，雖然延長了孕周，但由于此類病情發展迅猛，嚴重的并發癥不但會導致孕產婦器官功能損害，反而增加了圍產兒患病率、病死率。本課題組研究孕婦血清2-ME水平與保守治療(期待療法)時間呈正相關(r=0.694，P<0.05)，提示低2-ME水平的早發型子癇前期患者延長孕周時間有限，需根據病情變化，適時終止妊娠。

COMT是雌二醇、兒茶酚胺降解的關鍵酶，廣泛存在于人體各個器官，在孕婦胎盤、肝臟、腦組織中含量高。COMT根據蛋白定位分為胞漿型(S-COMT)和膜結合型(MB-COMT)兩種蛋白亞型，孕婦胎盤COMT以胞漿型為主。2008年KANASAKI 等[1]通過實驗敲除小鼠COMT基因，成功制造子癇前期小鼠模型。這些COMT基因敲除小鼠給予2-ME灌胃，子癇前期癥狀得到較大改善。LEE等[12]發現在3例重度子癇前期患者胎盤中發現COMT表達降低，與KANASAKI[1]結論一致。2017年的一項動物實驗研究發現COMT缺乏可誘發高血壓，機制可能與其促進機體對血管緊張素Ⅱ敏感性有關；而2-ME可通過彌補COMT缺乏來改善血壓紊亂[15]。這些研究結果似乎證明了胎盤中COMT的活性與子癇前期發病關系密切，但這些研究從統計學意義上來說，病例數非常有限。本實驗中亦未發現COMT在2組孕婦體內存在差異。因此提示2-ME在子癇前期孕婦體內水平降低原因可能不一定是COMT酶水平降低和/或活性減少；亦有可能其他代謝途徑的異常導致，比如S-腺苷蛋氨酸的生物利用度降低或17β-雌二醇生物利用度下降等[16]。由以推測相對于COMT，2-ME可能對促進母體妊娠期胎盤正常發育及保護血管內皮功能有更積極的作用。

4 結 論

血清2-ME水平降低可能會導致子癇前期發生，通過檢測子癇前期患者血清2-ME水平與健康孕婦血清2-ME水平，及時掌握病情嚴重程度，可能對指導延長孕周，適時終止妊娠，達到降低子癇前期母兒相關并發癥的發生率、改善孕婦和胎兒的不良結局有一定作用。