慢性乙型肝炎感染患者血清CTGF表達及與肝纖維化、Th17/Treg平衡的關系

王 慧，許劍蘭，鄭成芳，陳靈芝

(海南西部中心醫院感染科，海南儋州 571700)

慢性乙型肝炎(CHB)是由于感染乙型肝炎病毒(HBV)并在患者體內復制而引起機體自身免疫反應，造成肝臟炎癥損傷的一種全球范圍內的感染性疾病。CHB患者主要表現為腹脹、惡心、身體乏力、肝區疼痛、脾大等臨床癥狀[1]。HBV感染后患者病情可逐漸惡化形成肝硬化、肝衰竭、肝癌等嚴重肝臟疾病，損傷患者生命健康。據有關研究報道[2]，HBV侵入機體之后，在人體肝臟細胞內自我復制，誘導機體免疫反應，引起免疫細胞輔助性T淋巴細胞17(Th17)、調節性T淋巴細胞(Treg)、Th2、Th1等的共同作用，其中Th1、Th2共同調控肝臟免疫應答，Th1/Th2水平失衡影響肝臟纖維化發生發展進程。Th17、Treg共同起源于T淋巴細胞，近幾年發現其也與肝臟炎癥反應、肝臟纖維化進程相關，Th17主要參與炎性反應，Treg主要參與抗炎反應，但其具體作用機制尚待研究[3]。還有研究表明結締組織生長因子(CTGF)具有分泌特性，其作為轉化生長因子(TGF)的下游效應介質，能夠與TGF-β共同誘導腎間質纖維化的形成[4]。但關于CTGF、Th17/Treg在CHB中的表達情況及與肝臟纖維化的的研究鮮有報道，因此本研究主要分析CTGF與肝纖維化、Th17/Treg平衡在CHB患者的表達情況及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究收集2016年6月至2018年6月在本院確診的CHB患者資料146例(研究組)為研究對象，其中男76例，女70例，年齡30～76歲，平均年齡(45.64±10.85)歲，根據慢性乙型肝炎防治指南[5]將肝纖維化程度將其分為S0期34例，S1期30例，S2期28例，S3期29例，S4期25例。納入標準：(1)符合2010年中華人民共和國“慢性乙型肝炎防治指南”的診斷標準[5]；(2)患者及家屬均知情且簽署同意書。排除標準：(1)合并其他病毒重疊感染或混合感染；(2)近1個月服用治療CHB的藥物者；(3)妊娠期、哺乳期婦女；(4)合并嚴重心肺功能障礙患者；(5)近期患有全身性炎癥疾病和自身免疫性疾病者；(6)近期有細菌、病毒等感染病。本研究經本院倫理委員會批準。另選取同期在本院體檢的健康者90例作為對照組，其中男48例，女42例，年齡32～75歲，平均年齡(45.05±11.35)歲，對照組所有研究對象均經過血常規、生化分析、B超檢測等證明無肝臟疾病。2組研究對象性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 儀器與試劑 丙氨酸氨基轉移酶(ALT，批號：20150619)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST，批號：20150822)、總膽紅素(TB，批號：20150625)試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；CTGF、白細胞介素-17(IL-17)試劑盒購自美國ADL公司。全自動生化分析儀型號為7600，購自日立公司；酶標儀型號為550，購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀型號為MoFloAstrios EQ，購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集與處理 清晨空腹采集本研究所有受試者靜脈血6 mL，分為兩份，一份于室溫下靜置20 min，以2 500 r/min轉速離心15 min，吸取上層血清分裝于無菌管中，置于-80 ℃冰箱中保存備用；一份置于肝素鈉采血管中，用于Th17和Treg的檢測。

1.3.2 肝功能指標的檢測 肝功能指標ALT、AST、TB水平，均采用日立7600全自動生化分析儀測定，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.3.3 血清CTGF、IL-17水平的檢測 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清CTGF、IL-17的水平，具體檢測步驟按照試劑盒說明書進行，酶標儀進行檢測記錄波長450 nm時的A值，繪制標準曲線計算待檢樣品濃度。

1.3.4 Th17和Treg的檢測 取肝素鈉采血管中的血液，梯度離心提取外周單個核細胞(PBMC)。參照流式細胞儀操作說明對細胞進行固定、染色、透化，分別對Th17、Treg 進行胞內染色，1h內使用流式細胞儀檢測，計算Th17、Treg百分率及Th17/Treg比值。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組研究對象性別、年齡、體質量指數(BMI)比較差異均無統計學意義(P>0.05)；研究組ALT、AST、TB均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 2組血清CTGF、IL-17水平及Th17、Treg百分率比較 與對照組相比，研究組CTGF、IL-17水平顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，研究組Treg百分率降低(P>0.05)，Th17百分率顯著升高(P<0.05)，Th17/Treg比值顯著升高(P<0.05)，見表2。

2.3 不同纖維化程度血清CTGF、IL-17水平及Th17、Treg百分率比較 隨著纖維化程度加深，血清CTGF、IL-17水平及Th17、Th17/Treg比值逐漸升高，Treg百分率逐漸降低，其中S1～4期血清CTGF、IL-17水平及Th17、Th17/Treg比值均顯著高于S0期(P<0.05)，Treg百分率均顯著低于S0期(P<0.05)，見表3。

表1 兩組臨床資料比較

表2 2組血清CTGF、IL-17水平及Th17、Treg百分率比較

表3 不同纖維化程度患者血清CTGF、IL-17水平比較

2.4 血清CTGF、Th17/Treg水平與IL-17、Th17、Treg相關性 Pearson相關性分析，CTGF與Th17/Treg、IL-17、Th17呈正相關(r=0.670、0.603、0.618，P<0.05)，與Treg呈負相關(r=-0.609，P<0.05)；Th17/Treg與IL-17、Th17呈正相關(r=0.703、0.645，P<0.05)，與Treg呈負相關(r=-0.683，P<0.05)；Treg與IL-17、Th17呈顯著負相關(r=-0.598、-0.624，P<0.05)，Th17與IL-17呈正相關(r=0.651，P<0.05)。

2.5 ROC分析CTGF、Th17/Treg比例對CHB患者的診斷意義 ROC分析檢測CTGF、Th17/Treg表達水平對CHB的診斷價值，結果顯示CTGF靈敏度為68.9%、特異度為56.7%、截斷值為24.191 5 ng/mL、ROC曲線下的面積(AUC)為0.695；Th17/Treg靈敏度為77.8%、特異度為67.8%、截斷值為0.853 1，AUC面積為0.753。見圖1、表4。

注：A為CTGF對CHB的診斷價值；B為Th17/Treg表達水平對CHB的診斷價值

圖1 血清CTGF、Th17/Treg的ROC曲線圖

3 討 論

HBV在各國都有分布，其可通過血液、性接觸、醫源接觸等途徑傳播，其傳播途徑較為廣泛且疾病治愈困難。目前每年有大約100萬患者死于HBV感染，近年來隨著HBV感染人數的增多，對CHB的預防和治療成為全球性亟待解決的公共健康問題。CHB發病機制復雜，目前研究者認為其與免疫系統紊亂密切相關，CD4+細胞亞群Th1/Th2失衡被認為是引起肝臟損傷的主要原因[6]。近年來隨著研究的深入，逐漸發現CD4+細胞亞群的Th17、Treg在CHB的免疫反應中也發揮重要作用。孫強等[7]研究發現，CHB患者外周血Th17比例及IL-17顯著高于對照組，認為Th17在CHB患者機體內具有免疫激活作用。STOOP等[8]研究表明，Treg細胞在CHB患者外周血中的比例顯著低于對照組。CTGF是TGF-β的下游效應介質，主要由肝星狀細胞分泌，IL-17可以激活肝星狀細胞。故本研究檢測分析CHB患者中血清CTGF、Th17、Treg水平，以期為CHB的診治提供理論依據。

Th17細胞是在自身免疫性疾病的研究中發現的輔助性T細胞，具有較強的促炎作用，其主要生物學作用通過IL-17表達，其主要分泌IL-17，IL-6、IL-21等炎癥因子[9]。在HBV感染后，Th17細胞分泌IL-17作用于靶細胞，刺激炎癥介質釋放，誘導機體炎癥反應，損傷肝臟組織[10]。研究表明，Th17還可促進IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的表達，引起組織細胞的浸潤促進炎癥的發生發展[11]。Treg細胞可向CD4+T細胞、B細胞、NK細胞等釋放TGF-β、IL-10等抗炎因子抑制自身免疫反應，減弱炎癥反應對組織的損傷[12]。近年來研究表明，在CHB患者中，Treg細胞明顯降低，其能夠抑制HBV特異性CD8+的增殖，預防過度免疫應答引起的肝臟組織細胞損傷[13]。機體內Th17誘導炎癥發生，Treg抑制炎癥反應，二者共同維持機體的免疫狀態。Th17與Treg在正常機體狀態下處于相對平衡，TGF-β抑制效應T細胞的活化、誘導Treg細胞的增殖；在炎癥反應中IL-6抑制Treg細胞的增殖，誘導Th17細胞的增殖，導致Th17/Treg比值失衡，引起全身免疫應答異常[14]。本研究結果顯示患者Th17細胞頻率顯著升高，Treg細胞頻率降低，Th17/Treg比值升高。ALT、AST、TB作為檢測肝臟功能重要的指標，其水平顯著升高表明肝臟受到嚴重損傷，可能與病毒性肝炎引起的炎癥作用相關。研究表明，慢性肝炎患者IL-17水平與ALT呈正相關[15]。本研究中，ALT、AST、TB水平均顯著升高，表明其與CHB疾病發展相關。Pearson相關性分析顯示Th17/Treg與患者血清炎性因子IL-17呈顯著正相關，說明Th17、Treg可能與CHB的發生及發展過程相關。ROC曲線分析顯示Th17/Treg的AUC面積為0.753，截斷值為0.853 1，表明Th17/Treg比值大于0.853 1時有可能患有CHB，其表達水平可作為臨床早期診斷CHB的理論依據。

CTGF屬于CNN多肽家族，是TGF-β的下游效應介質，能夠誘導纖維母細胞基因的表達、誘導成纖維細胞增殖、分化[16]。肝臟纖維化是機體肝臟組織受到長期炎癥刺激產生的病理狀態[17]。機體正常狀態下，TGF-β表達量少，在肝臟纖維化過程中，其在纖維間隔、肝竇內皮細胞等表達升高，CTGF也表達升高，且隨纖維化程度升高表達增加，CTGF的高表達與肝臟纖維化程度密切相關[18]。ABOU-SHADY等[19]研究表明肝硬化組織標本中CTGF mRNA表達升高，提示其與肝纖維化相關。研究表明IL-17可以激活肝星狀細胞，而CTGF主要來源于肝星狀細胞，在HBV感染的患者中Th17細胞分泌IL-17顯著升高，上調CTGF表達[20]。本研究結果顯示患者血清CTGF水平顯著升高，CTGF與IL-17、Th17呈顯著正相關，與Treg呈顯著負相關，CTGF與Th17/Treg比值呈顯著正相關，表明IL-17的增加促進CTGF的分泌。CTGF與Th17/Treg平衡在CHB的發展過程中具有重要作用。ROC分析顯示CTGF的AUC面積為0.695，截斷值為24.191 5 ng/mL，表明CTGF可作為CHB臨床早期診斷指標。

4 結 論

CHB患者血清CTGF隨肝纖維化程度加重而增加，CTGF與Th17/Treg呈顯著正相關，且二者均可作為CHB患者的早期臨床檢測指標，但本研究由于樣本數量較少，未對遠期療效進行隨訪，存在不足之處，今后將重視擴大樣本數量進行深入研究。