血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性與南京地區(qū)老年阿爾茨海默病病人認(rèn)知關(guān)系的研究

束婷婷 潘曉東 何一然 劉雅玲 孫曉萌 呂志剛 婁青林

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是最常見(jiàn)的以記憶力損害為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，已經(jīng)成為繼心血管疾病、腫瘤和腦卒中之后的第四位死亡原因。我國(guó)癡呆病人從1990年的368萬(wàn)上升至2010年的919萬(wàn)，其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而明顯增加，65歲以下癡呆的發(fā)病率僅為0.26%，到了95歲以上發(fā)病率高達(dá)60.5%［1］。AD已成為老齡化社會(huì)面臨的重要健康難題。

AD的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前以腦細(xì)胞外β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）致病學(xué)說(shuō)為主流意見(jiàn)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為：在疾病的發(fā)生發(fā)展中，腦細(xì)胞外Aβ（主要形式為Aβ42）在腦內(nèi)異常沉積并導(dǎo)致細(xì)胞損害，Aβ42的聚集與認(rèn)知功能減退呈正性相關(guān)［2］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）可抑制 Aβ 的沉積，在多個(gè)位點(diǎn)對(duì)Aβ42進(jìn)行剪切，減少Aβ42在腦中的蓄積［3］。ACE第16個(gè)內(nèi)含子是一段本身長(zhǎng)度為287 bp的alu序列的插入（I）或缺失（D）所導(dǎo)致ACE基因I／D多態(tài)性，可調(diào)控血ACE的水平及對(duì)Aβ的剪切，因此可能參與調(diào)節(jié)AD發(fā)病進(jìn)程［4］。本研究旨在調(diào)查南京地區(qū)老年AD病人ACE基因I／D多態(tài)性的分布，并探討其與AD的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2011年1月至2017年8月在我院門(mén)診及住院就診的年齡≥70歲的AD病人149例為病例組（AD組）。AD診斷參照美國(guó)神經(jīng)病學(xué)語(yǔ)言障礙和卒中老年性癡呆和相關(guān)疾病學(xué)會(huì)（NINCDSADRDA）的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。 入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）本人或家屬同意并簽署知情同意書(shū)；（2）家庭成員平均月薪＞5000元；（3）可以完成相關(guān)的神經(jīng)心理學(xué)量表。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）最近2個(gè)月內(nèi)有急性病發(fā)作或處于疾病危重狀態(tài)；（2）有明確精神疾病病史；（3）獨(dú)居而無(wú)知情者提供信息。另選取同期無(wú)記憶力下降主訴、無(wú)嚴(yán)重軀體疾病及精神病史、日常生活完全自理、年齡≥70歲的老年人113例為對(duì)照組（NC組）。本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)審核。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)心理學(xué)量表評(píng)估：由受過(guò)專(zhuān)門(mén)訓(xùn)練的神經(jīng)科醫(yī)師收集入組者的神經(jīng)心理學(xué)量表資料。量表包括：蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）、簡(jiǎn)易智能狀態(tài)檢查量表（Mini-Mental State Examination，MMSE）、額葉功能評(píng)估量表（Frontal Assessment Battery，F(xiàn)AB）、臨床癡呆評(píng)定量表（Clinical Dementia Rating，CDR）、認(rèn)知障礙簡(jiǎn)明評(píng)價(jià)量表（Cog-12）［6］。

1.2.2 臨床指標(biāo)采集及檢測(cè)：所有受試者清晨測(cè)量血壓，空腹時(shí)采集靜脈血8～10 mL，分裝于兩抗凝管中，一管用于生化及糖化血紅蛋白（HbA1c）的檢測(cè)，另一管用于全血DNA提取及后續(xù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 ACE基因I／D多態(tài)性檢測(cè)：提取全血DNA，采用Biospin全血基因組DNA提取試劑盒（杭州日博科技有限公司），具體步驟參照試劑盒說(shuō)明。合成ACE多態(tài)性檢測(cè)引物：上游引物 5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′； 下 游 引 物 5′-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGA-3′（捷瑞公司）。PCR檢測(cè)反應(yīng)體系及條件：PCR擴(kuò)增酶采用Taq DNA Polymerase擴(kuò)增試劑盒（諾威贊），反應(yīng)體系共 20 μL：10 μL PCR Mix 緩沖液；1 ng DNA 模板；引物各 0.2 μmol／L，蒸餾水補(bǔ)足體積至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)，終末72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物鑒定：2%瓊脂糖凝膠電泳（biofroxx公司），1xTBE緩沖液，電泳電壓為90 V，電泳時(shí)間為40 min，電泳儀器 BIORAD，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。將分組變量作為應(yīng)變量，納入單因素分析有意義的變量，采用enter法進(jìn)行Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組基線資料比較 2組年齡、受教育年限、卒中史、吸煙史、HbA1c差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。 見(jiàn)表 1。

表1 2組基線資料比較（

表1 2組基線資料比較（

注：與 NC 組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

?

2.2 2組神經(jīng)心理學(xué)量表評(píng)分比較 NC組神經(jīng)心理學(xué)量表得分情況均優(yōu)于AD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 見(jiàn)表 2。

表2 2組神經(jīng)心理學(xué)量表評(píng)分比較（，分）

表2 2組神經(jīng)心理學(xué)量表評(píng)分比較（，分）

注：與 NC 組比較，??P＜0.01

?

2.3 2組基因型分布比較 2組間ACE基因型及等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：病例組II基因型頻率明顯高于對(duì)照組，D等位基因的頻率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。 見(jiàn)表3。

2.4 AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析 以是否為AD病人為應(yīng)變量，選取年齡、受教育年限、卒中史、吸煙史、HbA1c、ACE基因型為自變量進(jìn)行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示受教育年限低、無(wú)吸煙史、高HbA1c、ACE II型純合子可能是AD發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表3 2組基因型分布比較（%）

表4 AD危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

3 討論

國(guó)內(nèi)外的研究顯示，ACE基因I／D的多態(tài)性與AD發(fā)生的關(guān)系密切，但不同的研究結(jié)果差異較大。ACE基因除可能通過(guò)血管途徑間接發(fā)揮作用外，其本身也直接參與Aβ的代謝過(guò)程，從而可能對(duì)AD的發(fā)生發(fā)展造成影響［7］。Kehoe的研究首次發(fā)現(xiàn)ACE基因D等位基因?yàn)锳D病人認(rèn)知能力的保護(hù)基因，但很快有學(xué)者得出了相悖的結(jié)論：認(rèn)為攜帶ACE DD型等位基因可增加認(rèn)知功能損傷的發(fā)生率［8］。還有結(jié)論認(rèn)為，ID及II型均增加了AD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其中I等位基因可能起主要作用［9］。上述研究結(jié)果差異的原因可能是血管性因素、高血壓、糖尿病等慢性疾病均為AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，ACE基因多態(tài)性分布也可能存在調(diào)控作用［7，10］。ACE通過(guò)對(duì)AD病人腦組織中Aβ42多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行剪切，使其向Aβ40形式轉(zhuǎn)變，同時(shí)增加鉀介導(dǎo)的乙酰膽堿釋放作用，上調(diào)記憶過(guò)程中的主要神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿的合成，從而穩(wěn)定AD病人的認(rèn)知功能并延緩其下降速度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AD組II基因型的分布頻率顯著高于對(duì)照組，Logistic回歸分析提示II純合子可能是AD的危險(xiǎn)因素，這與上述研究一致，但具體通過(guò)哪些途徑發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。

本研究提示卒中史是AD的影響因素。既往認(rèn)為腦血管病是血管性認(rèn)知障礙的危險(xiǎn)因素［11］。近年來(lái)的研究提示，血管性因素深入地參與了AD的神經(jīng)細(xì)胞變性退化的過(guò)程［12-14］。由于ACE基因已經(jīng)被證實(shí)與腦血管病有關(guān)，所以其可能通過(guò)多個(gè)途徑參與認(rèn)知功能衰退的過(guò)程。

本研究發(fā)現(xiàn)血糖水平對(duì)認(rèn)知功能有明顯影響，這與既往研究一致［15-16］。糖尿病不僅僅對(duì)血管性認(rèn)知障礙有作用，而且對(duì)AD的發(fā)生發(fā)展也造成不良影響。甚至有學(xué)者提出所謂“3型糖尿病”的假說(shuō)。筆者認(rèn)為，控制血糖可以作為AD（尤其是同時(shí)罹患糖尿病）病人認(rèn)知功能保護(hù)的切入點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，吸煙史對(duì)AD“有益”，但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)入組的吸煙者平均年齡較不吸煙者大，所以可能存在選擇性偏倚造成結(jié)果不可靠。而且，本研究為橫斷面研究，僅設(shè)計(jì)了詢問(wèn)是否有吸煙史，沒(méi)有進(jìn)一步分析吸煙總量、吸煙起始年齡、是否戒煙以及戒煙年限等信息，因此可能影響結(jié)果。

綜上，本研究提示，ACE基因多態(tài)性可能是老年AD發(fā)生發(fā)展的影響因素，其中II等位基因?qū)D的影響最明顯。但I(xiàn)I基因型具體是通過(guò)怎樣的分子機(jī)制途徑影響AD的發(fā)病過(guò)程還需要深入研究。