革蘭氏染色法觀察與區分細菌

譚 嘯 章熙東

(1 河海大學環境學院淺水湖泊綜合治理與資源開發教育部重點實驗室 南京 210098； 2 江蘇省南京外國語學校 南京 210008)

問題來源于生產與生活，知識運用于探索與實踐，基于真實情境下的生物學教學能讓學生接觸實際問題，了解真實現象，有效提升學生的生物學學科核心素養。在高中生物學教材中，細菌作為原核生物的代表被重點提及，作為影響人類健康的一些病原體也被學生所認知。于是在“利用顯微鏡觀察細胞”的實驗課中，學生觀察了諸如“草履蟲、黑藻、口腔上皮”等常見細胞后，有學生提出： 能否觀察細菌細胞，了解它們的真面目？因此，筆者推薦開展“革蘭氏染色法觀察與區分細菌”的實驗教學。

革蘭氏染色法是丹麥醫生C. Gram在1884年最先發明的。幾年后，德國病理學家C. Weighert改進并加入了番紅復染的步驟[1]。如今，革蘭氏染色法成為常見的微生物鑒別方法，細菌個體微小、結構簡單，通常呈透明狀態，未經染色的細菌在光學顯微鏡下難以觀察和區分。經革蘭氏染色后，陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色，可以清楚地觀察細菌的形態、細胞排列方式及某些結構特征，還可以用于細菌分類鑒定。

1 染色原理

革蘭氏染色法的原理解釋主要有三種： 等電點學說、化學學說、滲透學說。

等電點學說關注不同細菌的等電點差異，細菌的等電點在pH為2～5，在中性環境中，菌體帶負電，很容易與堿性染料結合(如結晶紫、甲基紫、以及教材經常提及的龍膽紫)，并且陽性菌的等電點(2～3)通常比陰性菌(4～5)低，媒染的碘液為弱氧化劑，可以降低陽性菌的等電點，使兩者等電點差異擴大。因而，初染的結晶紫與陽性菌的結合力比陰性菌強，不易被乙醇洗脫[2]。

化學學說關注革蘭氏陽性菌體內含有的核糖核酸鎂鹽-蛋白復合物。在初染和媒染后，核糖核酸鎂鹽-蛋白復合物、結晶紫、碘液三者在陽性菌細胞內結合，此結合物不易被乙醇洗脫。所以，陽性菌呈紫色。而陰性菌細胞內缺乏核糖核酸鎂鹽，碘與結晶紫的胞內攝入量少，并且不能牢固結合，易被乙醇洗脫。

滲透學說關注細菌細胞壁成分與結構。革蘭氏陽性菌細胞壁厚(約20～80 nm)，結構較簡單，主要含肽聚糖和磷壁酸；革蘭氏陰性菌細胞壁薄(約10 nm)，結構復雜，分外壁層和內壁層，外壁層又分三層： 最外層是脂多糖，中間是磷脂層，內層是脂蛋白。內壁含肽聚糖(含量低，結構松散)，不含磷壁酸。細菌在結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了碘與結晶紫的復合物，陽性菌由于細胞壁較厚、脂類含量低，肽聚糖網狀結構交聯致密，因而在乙醇脫色時，細胞因失水使網孔收縮，結晶紫與碘復合物滯留在壁內，細胞呈紫色。而陰性菌細胞壁薄且類脂含量高、肽聚糖含量低且交聯松散。在乙醇脫色時，含脂層迅速溶解，結晶紫與碘復合物很容易從薄而松散的結構中洗脫，再經紅色染料復染后，陰性菌就呈紅色。

20世紀60年代，Salton曾提出細菌細胞壁在革蘭氏染色中的重要作用[3]。1983年，Beveridge等[4]用鉑代替媒染劑碘液，再用電子顯微鏡觀察到結晶紫與鉑復合物可被陽性菌的細胞壁阻留，進一步證明了由于細胞壁化學成分的差異而引起染色反應的不同，滲透學說具有較強的說服力[5]。

2 實驗步驟與注意事項

革蘭氏染色需要用到的試劑及配制過程如下[1]： ①結晶紫試劑： 結晶紫2 g，草酸銨0.8 g， 95%乙醇20 mL，蒸餾水80 mL。先將結晶紫溶于乙醇，草酸銨溶于蒸餾水，然后將兩個溶液混勻置于密閉的棕色瓶，靜置48 h后使用。②碘液： 碘化鉀2 g，碘1 g，蒸餾水100 mL。為使碘充分溶解，應先溶解碘化鉀，再將碘溶于碘化鉀溶液。③番紅試劑： 番紅2.5 g，溶于100 mL 95%乙醇，取10 mL番紅乙醇溶液溶于80 mL蒸餾水，搖勻。

革蘭氏染色的各步驟中，脫色是最重要且最難把握的步驟。各步驟注意事項如表1。

3 “三步法”革蘭氏染色

上世紀末，出現了“三步法”革蘭氏染色。黃元桐等[8]把酒精脫色與復染的兩步合并，減少操作步驟、縮短時間、提高了效率。后來，洪慶華等[9]用0.4%堿性品紅乙醇溶液作為復染劑，可以達到脫色和復染雙重效果，結果準確率高、重復性好。在教學中，為方便學生操作，提高實驗效率，可以引入“三步法”的革蘭氏染色。

4 常見問題與分析

以下是革蘭氏染色實驗教學中常見的問題和原因分析：

表1 革蘭氏染色的注意事項

(1) 剛接種的細菌細胞濃度低且一些生理特征未完全表現，老齡的革蘭氏陽性菌由于衰亡或自溶導致細胞壁通透性改變而出現假陰性，應在細菌的對數生長期進行染色。

(2) 涂片不宜過厚，以免脫色不充分，造成假陽性。

(3) 成敗的關鍵步驟是乙醇脫色。如果脫色過度，陽性菌可被誤認為陰性菌；如果脫色不足，陰性菌會被誤認為陽性菌。

(4) 染色過程中切勿使載玻片上的染色液干涸，否則會形成染色液結晶顆粒，影響觀察。

(5) 用水沖洗后，應輕輕吸去殘水，避免復染液被稀釋而影響效果。

(6) 陽性菌的等電點比陰性菌低，在相同pH條件下進行染色，陽性菌細胞會吸附更多的堿性染料，不易脫去，而陰性菌則相反。所以，不能忽視染色時pH的影響。例如，在堿性條件，兩類菌吸附的堿性染料都多，可能都呈現陽性反應；在酸性條件，可能都呈陰性反應。

(7) 如果對未知菌的染色結果沒把握，可在同一塊載玻片上涂上與未知菌形態差異較大的已知細菌作為對照(如： 枯草芽孢桿菌或大腸桿菌)，這樣可以判斷染色結果的正確性和可靠性。

5 常見的革蘭氏陽性菌與陰性菌

革蘭氏染色法不僅可以鑒別真細菌，還可以用于鑒別古菌、真菌、藍細菌等。所有的放線菌和真菌，有芽孢的桿菌和大多數球菌，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、白喉桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、破傷風桿菌(Clostridiumtetani)、炭疽桿菌(Bacillusanthraci)、肺炎雙球菌(Streptococcuspneumoniae)等都呈革蘭氏陽性反應。藍細菌、弧菌、螺旋體、多數致病性的無芽孢桿菌都呈現革蘭氏陰性反應，如大腸桿菌(Escherichiacoli)、痢疾桿菌(ShigellaCastellani)、傷寒桿菌(Salmonellaenterica)、變形桿菌(Proteusspecies)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、百日咳桿菌(Bordetellapertussis)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)等。致病菌僅僅作為知識內容進行了解，在教學實驗操作中應避免涉及致病菌，在對環境樣品的分析中也要加強安全防護。