超高效液相色譜串聯質譜法（UPLC-MS/MS）測定榛子中乙烯利的殘留

趙立蘋 林 芳

（通標標準技術服務（上海）有限公司 上海 200233）

1 前言

乙烯利作為植物生長調節劑，具有植物激素促進乳液分泌，加速成熟、脫落、衰老及促進開花的生理效應。一定條件下，乙烯利不僅能釋放出乙烯，還能誘導植株產生乙烯，被廣泛運用在農業種植和生產方面，可以促進果實成熟、植株矮化、提高產量。乙烯利不僅對人體的皮膚、眼睛有刺激作用，對粘膜有酸蝕作用，同時也可對水體造成污染。過量乙烯利被食用后可加速消化道衰老，造成消化道潰瘍，對大腦和腎臟也有一定的損害。GB 2763—2016《食品安全標準 食品中農藥最大殘留限量》[1]中對谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、干制水果、堅果和調味料都規定了乙烯利的最大殘留量（MRL）。

乙烯利是一種極性較強的化合物，食品中乙烯利的檢殘留測方法主要有氣相色譜法[2,3]、離子色譜法[4-6]、液相色譜-串聯質譜法[7-9]。氣相色譜法中需要用到重氮甲烷甲基化試劑，操作要求較高且不方便，離子色譜法和液質聯用研究對象集中在水果和蔬菜方面，針對堅果類樣品研究較少。本文建立了一種超高效液相色譜串聯質譜法測試榛子中乙烯利的殘留研究方法，該方法操作簡單，可用于批量樣品中乙烯利的殘留檢測，為堅果類樣品的研究提供了方便。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜儀（Waters ACQUITY UPLC H-Class，Xevo TQ-s micro 型三重四級桿串聯質譜儀）；SF-TGL-16M 型高速離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；XW-80A 型漩渦器（上海青浦滬西儀器廠）；WS-150D 型振蕩搖床（德國 WIGGENS 公司）；950DAE 超聲儀（美國 ETL TESTING 公司）；DC24H-RT 型氮氣濃縮儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）；JA2003A 型電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；Milli-Q 型超純水儀（密里博中國有限公司）。OASIS WAX（3cc，60 mg，美國 Waters 公司）；針式聚四氟乙烯濾膜:0.45 μm（天津市津騰實驗設備有限公司）100 μL、1 000 μL 移液槍（德國 eppendorf 公司）。

乙烯利標準品（CAS No.16672-87-0，純度97.0%，AccuStandard）；Formic acid 甲酸（HPLC 級，美國 DiKMA公司，純度 99.0%）；Methanol 甲醇（HPLC 級，美國DiKMA 公司，純度 99.9 %）；Acetonitrile 乙腈（HPLC級，美國 DiKMA 公司，純度 99.9%）；Acetone 丙酮（HPLC 級，上海 ANPEL 公司，純度 99.5%）；Ammonium hydroxide 氨水（AR 級，上海凌峰化學試劑有限公司）；實驗用水均為一級水，符合相關國家要求。

精確稱取乙烯利標品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，配制成含乙烯利1.0 mg/mL的溶液，用甲醇逐級稀釋標準儲備液至1.0 μg/mL。分別準確移取 50 μL、100 μL、150 μL、200 μL 和500 μL 1.0 μg/mL 于 10 mL 容量瓶中，用 0.1%甲酸水定容至刻度，搖勻，配制成 5 μL、10μL、15 μL、20 μL和50 μg/L 的系列標準曲線溶液。

2.2 儀器條件

2.2.1 液相色譜條件

2.2.2 質譜條件

電離模式:電噴霧正離子源模式（ESI+）；多反應監測（MRM）；脫溶劑溫度:500℃；脫溶劑氣流速:1 000 L/Hr；毛細管電壓:3.0 kV；離子源溫度:150℃；孔電壓:36.0 V；駐留時間:0.054 s；監測離子對分別為 m/z145＞91、m/z145＞81，2 者的碰撞能分別為 12 V和 18 V，其中，m/z145＞91 為定量離子。

2.3 實驗步驟

榛子去殼，粉碎，混勻，稱取1.0 g（精確至0.01 g）榛子于50 mL 離心管中，加入40 mL 0.1%甲酸水搖勻，超聲提取30 min，10 000 rpm 離心 2 min。準確移取 2 mL 上清液過 WAX 柱（3 cc，60 mg，使用前用3 mL 甲醇，3 mL 水活化），上樣后分別用 3 mL 水和3 mL 甲醇淋洗，最后用5 mL 10%氨化甲醇進行洗脫，收集洗脫液，在40°C 下氮吹洗脫液至干，用2 mL 0.1%甲酸-水溶液復溶，過0.45 μm 濾膜，上機測試。

3 結果和討論

3.1 質譜條件的選擇

對1 mg/L 的乙烯利標準溶液在不接色譜柱的條件下，用電噴霧正離子模式（ESI+）進行母離子全掃描，確定乙烯利正離子模式的[M+H]+為m/z145；利用手動優化模式對子離子、孔電壓和碰撞能等參數進行優化，確認優化后的參數為m/z145＞91、m/z 145＞81 時，2 個離子對信號最強。根據優化后的最佳質譜條件建立ESI（+）的多反應監測方法。

3.2 流動相的選擇

表1 0.01 ng 乙烯利在不同流動相的響應值及信噪比（S/N）

3.3 前處理方式的選擇

3.3.1 提取溶液的選擇

因乙烯利極性較強，所以選擇了極性較強的溶劑作為提取液，研究了10%丙酮-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸-甲醇/水（1：1）、甲醇:水（1：1）對加標樣品（添加量為 0.2 mg/kg）的提取效率。結果表明，在4 種提取液種采用0.1%甲酸水溶液的提取效率最高，確定提取液為0.1%甲酸水溶液，詳見表2。

3.3.2 WAX 凈化柱洗脫液的優化

乙烯利是一種極性較強的弱陰離子化合物，選用OASIS WAX 弱陰離子交換SPE 柱子進行凈化。本實驗優化氨化甲醇溶液中氨水濃度及洗脫體積。對樣品中添加了乙烯利 0.2 mg/kg，做 1%、5%和10%氨化甲醇濃度水平分別在洗脫2.0 mL、5.0 mL和10.0mL 洗脫溶劑的交叉試驗，以回收率表示。選擇出最優的凈化洗脫條件（表3）。由表3可知，采用5 mL 10%氨化甲醇作為洗脫液體積時，可得到預期的洗脫效果，所以確定采用5 mL 10%氨化甲醇作為洗脫溶劑。

表2 乙烯利添加量0.2 mg/kg 時不同提取液的提取率

表3 0.2 mg/kg 加標在不同氨化甲醇中濃度用不同洗脫體積條件的回收率（%）

3.4 線性范圍和方法的檢出限

將配制 5μg/L、10μg/L、15 μg/L、20 μg/L 和 50 μg/L的系列標準曲線溶液注入超高效液相色譜串聯質譜儀測試，以峰面積對乙烯利的質量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。

參考GB/T 27417—2017 《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》[10]中空白偏差法評估方法檢出限和定量限。具體操作如下:分別在10 個空白樣品中加入乙烯利標準溶液，制成含有5 μg/L 的樣品溶液，分別注入超高效液相色譜串聯質譜儀測試，得乙烯利含量，計算乙烯利含量的3 倍標準偏差即為方法檢出限，10 倍標準偏差即為方法定量限，結果詳見表4。由表4可知，乙烯利在 5～50 μg/L 時，標注曲線的相關系數r 大于0.995，方法的檢出限為0.04 mg/kg，定量限為0.13 mg/kg。

3.5 準確度和精密度

在榛子樣品進行乙烯利標準溶液的加標回收實驗，加標水平分別為 0.2 mg/kg、0.4 mg/kg 和 1.0 mg/kg，采用相應處理方法對樣品進行處理，每個添加水平重復測定6 次，乙烯利在榛子樣品中的加標回收率及相對標準偏差詳見表5。由表5可知，乙烯利在榛子樣品中的回收率為90.0%～102.0%，RSD 為4.9%～8.2%，可以滿足定量分析的要求，說明所建立的方法是可行的。

表4 乙烯利的線性范圍、相關系數、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

表5 榛子樣品中不同濃度水平乙烯利的回收率和精密度（RSD）

4 結語

本文采用0.1%甲酸水溶液作為提取劑，經WAX柱凈化，采用超高效液相色譜串聯質譜法測試，建立了榛子堅果樣品中乙烯利殘留的檢測法方法。該方法操作簡便，C18 分析柱更方便實驗室的日常操作，具有提取溶劑環保，對環境污染小，回收率好，精密度高等特點，適用于堅果中乙烯利殘留的檢測。