高效液相色譜法提取和分析β-胡蘿卜素

陳君堯

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院 湖北武漢 430000）

1 前言

β-胡蘿卜素是一種非常常見的類胡蘿卜素。β-胡蘿卜素的顏色是黃色和橙色，很容易從水果和其他植物中提取。

β-胡蘿卜素不僅在食品技術中有許多用途，更重要的是，它對人體也有許多益處，因此，在研究中變得越來越重要。從食品科學的角度研究β-胡蘿卜素可以全面了解其成分、組成元素、化學性質和營養價值。

β-胡蘿卜素是一種抗氧化劑，但是對于吸煙者來說，他們攝入的β-胡蘿卜素的高含量可能會增加患癌癥的風險。因此，適量的β-胡蘿卜素有利于人體健康。

β-胡蘿卜素可以在人體內轉化為維生素A，而維生素A 是必需的維生素。維生素A 有許多重要用途，也有一些研究證實，通過飲食攝入β-胡蘿卜素中的維生素A 可以應用于人體的許多方面。例如，維生素A 有利于皮膚健康和黏液膜、免疫系統和視力；也有一些研究證明，每天攝入適量的β-胡蘿卜素可以減少癌癥和心血管疾病。

β-胡蘿卜素的另一個益處是其可以延遲認知辨別能力的下降。在人們的身體中，氧化應激是導致認知能力下降的主要原因，研究證實了這一點。在這種情況下，β-胡蘿卜素是一種抗氧化劑，可以防止認知能力的惡化，因為補充抗氧化劑可以調節機體的活性氧種類和抗氧化系統之間的平衡[1]。因此，越來越多的研究者將使用不同的抗氧化劑。本實驗采用高效液相色譜法對β-胡蘿卜素進行了分析。

高效液相色譜（HPLC）是分析化學中的一項現代技術。它用于檢測混合物的不同成分，依靠泵的功率使樣品混合物通過填充有固體吸附材料的柱，樣品中的不同組分與吸附材料有不同程度的反應，這將導致不同組分在管，最終結果是組件彼此分離[2]。此外，高效液相色譜根據物質的極性或是否為親水性組分離不同的物質。目前，高效液相色譜法已在許多應用中得到應用，例如，藥物、分離生物樣品的研究和醫學方面。在食品研究領域，高效液相色譜法也被廣泛應用于食品成分的研究，如脂質、維生素、氨基酸和無機陰離子等，是食品分析研究的熱點[3]。

2 材料與方法

2.1 材料

實驗器材:電動攪拌器；燒杯；錫箔；磁力攪拌器；真空過濾器；布氏漏斗；Whatman 42 號濾紙；收集瓶；100 mL 容量瓶；250 mL 圓底瓶；旋轉蒸發器；超聲波浴；高效液相色譜瓶；50 mL 容量瓶；25 mL容量瓶。

2.2 實驗方法

在電動攪拌器中對胡椒粉進行均質化，并在干凈、干燥的燒杯中稱取5 g 勻漿，燒杯確保用錫箔包裹。將 62 mL 萃取溶劑（甲醇）、2.5 g 無水硫酸鹽和0.5 g 碳酸鎂添加到勻漿中，并將所有成分混合5 min。在這一步中使用了磁力攪拌器，必須在煙霧柜中進行。在此過程中，燒杯被錫箔覆蓋，勻漿通過裝有Whatman 42 號濾紙的Buchner 漏斗真空過濾。在這個過程中，收集瓶和布氏漏斗的頂部被錫箔覆蓋。當沒有更多的濾液通過時，用2×10 mL 等份提取溶劑清洗濾餅。

清洗濾餅的濾液轉移到干凈、干燥的250 mL 圓底燒瓶中，在旋轉蒸發器中蒸發至干燥。將旋轉蒸發器的溫度控制在30℃～40℃，保持儀器不受光照。用超聲波浴將殘余物重新溶解在10 mL 甲醇中。最后，將溶液樣品注入高效液相色譜小瓶中，并在高效液相色譜中分析，條件為:波長450 nm、流動相（乙腈）∶四氫呋喃（THF）∶水為 85∶12.5∶2.5、流速 2.0 mL/min，在此條件下β-胡蘿卜素的保留時間應約為10 min。

2.3 樣品制備

稱取12.5 mg β-胡蘿卜素，溶解于最小體積的THF 中，用50 mL 容量瓶添加樣品，用THF 將 50 mL容量瓶定容，并用錫箔覆蓋。從儲備溶液中取出0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL 等分試樣，并將其轉移到單獨的25 mL 容量瓶中。用THF 將25 mL容量瓶定容，并用錫箔覆蓋4 個容量瓶，用上述高效液相色譜法對這些標準品進行分析。

3 實驗結果

標準溶液配置的濃度詳見表1，用高效液相色譜法測定的4 個濃度梯度和1 個樣品的含量詳見表2，β-胡蘿卜素標準線圖詳見圖1。

表1 標準溶液的濃度

表2 高效液相色譜法測定的4 個濃度梯度和1 個樣品的含量

（續表2）

圖1 β-胡蘿卜素標準線

未知濃度溶液的計算如下:

Y=1 016.5X+5.086 6，X 為樣品濃度，Y 為樣品峰面積=1 316.045，M 為坡度=1 016.500，C 為截距=5.086，Y=MX+C

重新排列得到結果如下:

X=（Y-C））/M 即 X=（1316.045-5.086））/1016.500=1.290 mg/L

參考值為100 g，但本實驗中，將5 g 樣品放入燒杯中，因此，需要將實驗值返回到參考值，并且2 個砝碼之間的差值的倍數為100/5=20。因此，最終計算結果需要乘以20。所以，未知溶液濃度的最終結果為 1.290×20=25.806 mg/100g。

4 討論與分析

4.1 批判性分析

在本實驗中，主要的誤差是光、氧、熱不能在實驗室中完全分離，β-胡蘿卜素對光、氧、熱、不穩定，因此，本實驗中的所有玻璃容器在整個過程中都被錫箔覆蓋。當實驗過程進行到真空過濾時，實驗員將燒杯的錫箔取出，通過布氏漏斗對勻漿進行真空過濾，由于光線的照射，使得β-胡蘿卜素的濃度低于正常值。此外，當使用旋轉蒸發器干燥圓底燒瓶時，助手應在此過程中除去錫箔。幸運的是，標準函數中的確定系數非常接近1（R2=0.995 3），這意味著4 個梯度標準數據非常匹配。

在第2 個實驗中，主要的誤差來自于溶液的定容和光照。由于透視上的差異，在這個過程中，改變了溶液體積，這可能導致標準溶液濃度的偏差。另一個產生誤差的原因是，當溶液轉移到HPLC 小瓶時，β-胡蘿卜素溶液的梯度濃度被倒入不同的燒杯中，在此期間，標準溶液暴露在光下。

4.2 方法比較

測定β-胡蘿卜素的方法還有很多，例如，紫外分光光度法和紙色譜法。

4.2.1 紫外分光光度法

對于紫外分光光度法而言，該方法檢測β-胡蘿卜素的優點在于，它能夠以簡單、快速的方式檢測成分，同時不會污染環境和降低成本；更重要的是，其具有較高的重現性和重復性，但主要缺點是精度不夠高[4]。

其操作方法如下:

樣品在玻璃燒杯中稱取1 g，振蕩15 min，向燒杯中加入5 mL 冷丙酮，溫度控制在約4℃，最后高速離心10 min，上層分離的上清液在另一管中收集。5 mL 丙酮和再萃取將活性化合物混合并離心，然后取上清液與第1 個上清液混合，將上清液通過Whatman 第42 號濾紙，在紫外-可見分光光度計中以449 nm 波長測定提取物的吸光度。

對胡蘿卜樣品的空白溶液進行梯度濃縮稀釋處理，提取方法與上述方法相同。通過后插法將光密度值繪制為濃度對應的標準曲線，從而計算β-胡蘿卜素的含量。

4.2.2 紙色譜法

紙色譜法利用混合物的不同極性和溶解性來實現分離，紙色譜法的優點是分離效率高，但操作步驟更為復雜，在進行大量的數據分析和處理時，有許多限制因素，而且不夠精確[5]。

其操作方法如下:

將濾紙切割成12 cm×14 cm 的形狀，確保邊緣必須垂直，在紙邊緣用鉛筆畫出1.5～2 cm 的線，將胡蘿卜汁浸入毛細血管中，放在鉛筆畫的直線上，重復多次，直到直線上有一個大約2 cm 的小圓圈，將12 cm 的端部卷成圓柱形，并使用回形針固定端部。將紙卷和一定量的分離液放入燒杯中，將燒杯密封5 min，然后取出濾紙，觀察β-胡蘿卜素的運動并記錄最遠的距離，最后計算β-胡蘿卜素的距離顏色行程/溶劑前行程即Rf 值。

4.3 實驗數據的改進

實驗中存在一定的誤差，這一系列結果之間的一致性程度可以通過重復性實驗進行檢驗。重復性實驗的定義是:同一方法、同一試劑、同一樣品進行多次實驗，2 個獨立試驗結果在概率水平為95%時的最大差異，由于一個實驗的偶然性，它是需要多次進行實驗以提高準確性。重復性實驗之所以重要，是因為無論是在機器加工上還是在樣品制備過程中，通常都會有一些誤差，但重復性實驗可以大大減少這些誤差。MENT 是最佳選擇，從統計學的角度來看，為了減少每組數據之間和每組數據內的誤差，進行了多次重復性實驗，同時計算平均值和標準差以確定重復性的成功，通常標準偏差值越小，重復性越好[6]。

在本實驗中，誤差可分為人為誤差和系統誤差兩大類。為了減少系統誤差，首先要做的是校準儀器。例如，在本實驗中，可以在實驗前向高效液相色譜中注入空白對照溶液，通過峰圖確定機器是否可以正常使用；另一種減小誤差的方法是多次重復實驗，因此也可以多次注入樣品溶液，并比較從機器獲得的數據。通過計算標準差，可以選擇最小值的數據，這是一種減少系統誤差的方法。

對于人為錯誤，這可以通過團隊來減少錯誤的發生。例如，在這個實驗中，β-胡蘿卜素樣品溶液可以被同一個團隊多次配置，每個團隊成員都將被分配任務，并且團隊成員可以互相監督以遵守實驗的步驟，每個步驟都將遵循實驗規則，避免了單一樣品溶液中的偶然誤差，最后通過對高效液相色譜分析數據的比較，選擇標準偏差最小的數據集作為最合適的實驗數據。