傳染性造血器官壞死病毒RT-RAA快速檢測方法的建立

呂曉楠 徐立蒲 張 文 王小亮 曹 歡 王靜波 王 姝

（北京市水產技術推廣站 北京 100176）

1 前言

傳染性造血器官壞死病（Infectious Hematopoietic Necrosis，IHN）是由傳染性造血器官壞死病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV）感染引起，嚴重危害虹鱒（含金鱒）等鮭科魚類的一種急性冷水魚病毒性傳染病，分布廣泛、發(fā)病率高，對我國鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大危害[1-4]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將IHN 列為必須申報的動物疫病。近年來，隨著水生動物及其產品的進出口貿易，IHNV也隨之在世界范圍內擴散，造成該病的感染率急劇增加，因此，IHN 的檢測和防治顯得愈發(fā)重要[5,6]。

該病的病原為IHNV，屬彈狀病毒科Rhabdoviridae，基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA。目前檢測IHNV 的方法主要有細胞分離培養(yǎng)、ELISA 和RT-PCR 方法等，均需借助專業(yè)設備完成檢測，缺少能夠現(xiàn)場檢測IHNV 的快速檢測技術[7-9]。本文通過一系列的引物設計篩選、體系建立以及試驗驗證等工作，建立了針對IHN 的逆轉錄重組酶介導擴增（Reverse Transcription Recombinase -Aid Amplifica -tion，RT-RAA）檢測技術，實現(xiàn)快速、靈敏的檢測IHNV。在養(yǎng)殖場發(fā)生疑似IHNV 感染時，可及時進行方便、快速的檢測，為IHN 的控制提供一種有效的工具。

2 材料與方法

2.1 樣品來源

健康和患病的魚樣品均由北京市水產技術推廣站水生動物疾病檢測技術中心收集及保藏。35 份IHNV 的檢測樣品均來自北京、新疆、貴州、云南、陜西、甘肅等虹鱒（含金鱒）養(yǎng)殖場。傳染性鮭魚貧血病毒（Infectious Samon Anaemia Virus，ISAV）、傳染性胰臟壞死病毒（Infectious Pancreatic Necrosis Virus，IPNV）和病毒性出血性敗血癥病毒（Viral Hemorrhagic Septicemia Virus，VHSV）樣品均由本實驗室保藏。

2.2 主要試劑與儀器

PCR 儀（Veriti 96 well Thermal cycler，Applied Biosystems）；熒光 PCR 儀（7500 real timePCR system，Applied Biosystems）；電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠）；凝膠成像儀（ChampGel5000,北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

RNeasy Mini Kit 試劑盒（QIAGEN，德國）；RTRAA 恒溫熒光檢測試劑盒（杭州眾測生物技術有限公司）；2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技術有限公司）；引物和探針(上海生工)。

2.3 方法

2.3.1 RT-RAA 引物的設計

以NCBI 數(shù)據(jù)庫中IHNV G 基因序列為靶位點，依據(jù)RT-RAA 引物設計原則，采用DNAMAN 6.0 軟件進行序列比對分析，選取同源性高的片段，用primer primer 5.0 進行引物設計，詳見表1。

表1 IHNV 引物和探針序列

2.3.2 重組質粒的構建與定量

由北京華大基因合成IHNV G 基因序列（1527bp），并克隆至pUC57 載體上，構建成標準質粒pUC57-IHNV，標準質粒濃度約為269.4ng/μL，推算出pUC57-IHNV 質粒拷貝數(shù)大約是 6.39×1010copies/μL。

2.3.3 RNA 的提取

樣品取魚肝、腦、脾、腎組織，勻漿后加含M199 細胞培養(yǎng)液（含10%的胎牛血清、1000IU/mL 的青霉素和1000IU/mL 的鏈霉素），4℃下 6 000 r/min 離心 20 min，收集上清液用于RNA 的提取。

2.3.4 實時熒光逆轉錄重組酶介導核酸擴增反應條件

RT-RAA 反應體系配方表詳見表2。

表2 RT-RAA 反應體系配方表

按照表2配置反應體系，混合均勻，加入到RTRAA 熒光反應單元干粉管中，使干粉重懸均勻，瞬時離心。再向每個反應管中加入2.5 μL B Buffer 反應液（內含MgAc）。將上述反應溶液放到熒光PCR儀中，37℃反應20 min。陰、陽性對照按照同樣方法進行操作。

2.3.5 靈敏度實驗

為了比較本文建立的RT-RAA 檢測方法與國際OIE 提供的參考方法RT-PCR 的檢測靈敏度，將標準質粒pUC57-IHNV 進行10 倍系列稀釋，濃度分 別為 105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL。每個稀釋度取 2 μL 作為模板分別加入到RT-RAA 和RT-PCR 反應體系中，分別參照對應的方法進行擴增、比較。

2.3.6 特異性驗證

利用本實驗室確定的IHNV 陽性樣品和3 份IHNV 為陰性的其他鮭鱒RNA 病原陽性樣品（包括ISAV、IPNV 和 VHSV）作為 RT-RAA 檢測模板，分別加入到RT-RAA 反應體系中，以測試本研究建立的IHNV RT-RAA 檢測方法的特異性。

2.3.7 與其他檢測方法檢測符合性的比較

用本文所建立的RT-RAA 檢測方法與GB/T 15805.2—2017《傳染性造血器官壞死病診斷規(guī)程》[10]中RT-PCR 方法對35 個虹鱒（含金鱒）養(yǎng)殖場樣品進行檢測。采用OIE《水生動物診斷試驗手冊》推薦的診斷敏感性和診斷特異性計算方法，對2 種方法的檢測結果進行比較。

3 結果

3.1 RT-RAA引物的設計和篩選

經(jīng)過NCBI 數(shù)據(jù)庫中多條IHNV-G 基因序列的比對，選取同源性較高的片段，共設計3 對引物和1條探針（具體信息表1）。以IHNV 質粒pUC57-IHNV為模板，分別對這些引物進行測試，選取擴增信號強，擴增時間短的引物組合（IHNV-1-F/IHNV-1-R），作為最終選擇的引物，進行后續(xù)的實驗。

3.2 RT-RAA檢測IHNV的靈敏度

將梯度稀釋的 105～101copies/μL 的 IHNV 陽性質粒為模板，加入到檢測管中對其進行檢測，從熒光結果（圖1）可以看出，100 copies/μL 的陽性質粒有明顯的熒光值，表明IHNV 的RT-RAA 恒溫熒光快速檢測方法靈敏度為100 copies/μL。RT-PCR 方法檢測結果顯示（圖2），其最低能檢測到質粒濃度為100 copies/μL。綜上建立的IHNV RT-RAA 檢測方法和國際OIE 提供的參考方法IHNV G 基因的RT-PCR 方法靈敏度相當，且RT-RAA 檢測時間為20 min，而RT-PCR 檢測時間（包含核酸電泳）至少需要210 min。

3.3 RT-RAA檢測IHNV的特異性

利用本文研發(fā)的IHNV 的RT-RAA 恒溫熒光快速檢測方法對1 份IHNV 陽性樣品和3 份IHNV為陰性的其他鮭鱒病原陽性樣品，包括ISAV、IPNV和VHSV 進行檢測，從熒光結果（圖3）可以看出，除IHNV 陽性樣品有熒光值以外，陰性對照和其他鮭鱒樣品均未檢測到熒光信號。結果表明，IHNV 的RT-RAA 恒溫熒光快速檢測方法對含有其他鮭鱒病原核酸的樣品RNA 無交叉反應，該技術具有良好的特異性。

圖1 RT-RAA 檢測方法的最低檢測限

圖2 RT-PCR 檢測方法的最低檢測限

圖3 RT-RAA 特異性分析

3.4 RT-RAA方法和RT-PCR方法符合性的比較

利用本文建立的IHNV RT-RAA 方法和國際OIE 推薦的參考方法RT-PCR 對來自全國6 個省市的35 份虹鱒（含金鱒）養(yǎng)殖場的樣品進行檢測，部分樣本的檢測結果詳見圖4和圖5。采用RT-PCR 方法的陽性檢出率為（25/35），采用本文建立的RTRAA 方法的陽性檢出率為（23/35）。根據(jù) OIE《水生動物診斷實驗手冊》 推薦的診斷敏感性和診斷特異性計算方法，本文建立的RT-RAA 方法對IHNV 檢測結果在診斷特異性上的符合率為100%，在診斷敏感性上的符合率為92%。說明RT-RAA 方法基本可以用來檢測IHNV，且檢測準確快速，20 min 內即可完成檢測。

圖4 RT-RAA 方法檢測實際樣本

圖5 RT-PCR 方法檢測實際樣本

4 討論

自1985年以來，我國已相繼在多地發(fā)現(xiàn)并報道IHN 疫情，該病給鮭鱒魚的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[11-14]。2008年，農業(yè)農村部《一、二、三類動物疫病病種名錄》將其列為二類動物疫病，隨后該病還列入國家動物疫病監(jiān)測計劃。由于該病尚無有效的治療方法，在病原的早期快速檢測對疾病的控制至關重要。

目前OIE 推薦的諸多診斷方法中，病毒分離、中和試驗等傳統(tǒng)病毒檢測方法費時費力；ELISA 等免疫學檢測方法，具有快速高通量的優(yōu)點，但前期需準備特異性抗體，費時費力，并且操作步驟煩瑣，存在一定漏檢情況。國內由于受到抗體來源的限制，免疫學技術方面的研究比較缺乏；目前RT-PCR 是較為常見檢測IHNV 的分子生物學方法，但檢測時間長、對儀器設備溫度精準度和人員操作技術要求極高、設備投入大且容易造成氣溶膠污染。因此上述方法均不適用于IHNV 的現(xiàn)場快速檢測。

逆轉錄重組酶介導擴增檢測技術（RT-RAA）是通過設計RT-RAA 引物，采用源于真菌或細菌的重組酶，并結合RNA 逆轉錄酶以及DNA 聚合酶，替代了PCR 高溫變形循環(huán)過程，從而實現(xiàn)了在37℃～39℃常溫條件下，快速、靈敏檢測目的基因片段。RTRAA 方法靈敏度高、特異性好、可將RNA 直接作為模板，無需額外逆轉錄過程、操作流程簡便、檢測周期短、不需要高溫循環(huán)，沒有升降溫處理、不需要昂貴PCR 儀器（僅需攜帶手持便攜恒溫裝置），結合熒光探針能夠實現(xiàn)實時檢測以及現(xiàn)場快速檢測[15-20]。

本文以IHNV 高度保守G 基因為模版，設計特異性RT-RAA 引物和探針，建立了IHNV 的逆轉錄重組酶介導擴增檢測技術。結合RNA 提取法，不需要單獨逆轉錄RNA 以及凝膠電泳等其他輔助，操作簡單無需專業(yè)人員操作，僅需將樣本放入37℃恒溫反應20 min，即可通過熒光曲線來判斷樣品是否感染了IHNV。本方法可最低檢測到100 個病毒拷貝，靈敏度與RT-PCR 方法相當，且檢測時間縮短為RT-PCR 的1/10。本方法還具有良好的特異性，僅與IHNV 特異性的發(fā)生反應，而與IPNV 等3 種鮭鱒魚病病原RNA 均不發(fā)生交叉反應。

采用本方法和RT-PCR 方法同時對35 份虹鱒（含金鱒）樣品進行檢測2 種方法的檢測結果符合率為96%，在診斷特異性上的符合率為100%，在診斷敏感性上的符合率為92%。本文建立的RT-RAA 檢測方法可高效、準確、快捷地從虹鱒（含金鱒）樣品中檢測到IHNV 陽性。值得注意的是，用RT-RAA 方法檢測實際樣本時，有2 份陽性樣品擴增信號偏弱，這對結果判定造成干擾，提示在后續(xù)研究中需要進一步優(yōu)化實驗體系提高檢測靈敏度。

綜上所述，本文建立的IHNV 實時熒光RTRAA 核酸檢測方法操作簡單、特異性好、靈敏度高，反應只需要20 min，大大縮短了反應時間，擺脫了復雜儀器的束縛，完全滿足基層、小型實驗室或現(xiàn)場檢測的需求，為IHNV 快速檢測提供了一種新的技術與方法。該技術具有廣泛的應用場景，將為IHNV 控制措施提供檢測技術支撐。