添加擴增內標的重組酶聚合酶擴增技術（RPA-IAC）檢測創傷弧菌

李 偉 莊濠宇 溫爾英 張崢嶸 黃琦容 周廣彪*

（1.梅州海關 廣東梅州 514021；2.揭陽海關；3.汕頭海關）

1 前言

創傷弧菌(Vibrio Vulnificus)廣泛存在于蟹、蝦等水生動物中，是海水養殖及加工產品中常見的致病性弧菌。創傷弧菌具有暴發性強、死亡率高、不易控制等特點，一旦暴發就難于控制，往往帶來巨大的經濟損失。同時，創傷弧菌還是一種人與動物共患的致病菌，誤食其污染的海產品，容易造成原發性敗血癥和軟組織感染，是引起食物中毒最為嚴重的食源性疾患之一。因此，對創傷弧菌進行快速檢測，在食品安全領域具有很重要的意義[1]。

目前，創傷弧菌的檢測以常規的微生物法為主，該法存在檢測時間長、靈敏度低、操作煩瑣、受環境及主觀因素影響較大等缺陷，同時創傷弧菌由于受饑餓和物理系壓力等因素影響，可能進入活的非可培養狀態(Viable But Non-Culturable State,VBNC)[2]，從而不能被常規方法所檢測。由于常規方法的諸多缺陷，建立一種快速、準確的現代食品安全監督檢測的實驗方法勢在必行。在諸多食源性致病菌檢測手段中，重組酶聚合酶擴增技術（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是一種由重組酶、單鏈 DNA 結合蛋白和鏈置換Bsu 聚合酶參與的恒溫擴增新技術,是近年來建立的一種新的核酸恒溫擴增技術。該法具有操作簡單、靈敏度高、特異性強、可在短時間內快速擴增出目的片段等優點, 在早期的動物疫病診斷、現場查驗、進出口商品快速檢疫等方面具有良好的應用潛力[3-6]。

擴增內標一般是將一段人工構建的DNA 序列或一段致病菌的看家基因序列，添加到PCR 反應體系中，用于指示是否存在假陰性現象。在PCR 反應時，既定序列與目標基因一起進行擴增，如果操作失誤或存在較多抑制物時，本該擴增的內標片段不能被擴增，從而達到指示反應假陰性的目的[7]。

由于受抑制劑等因素的影響，在RPA 檢測中也容易出現假陰性結果，在一定程度上限制了其在實際檢測工作中的應用。針對RPA 反應中存在的假陰性而影響其檢測準確性的問題，本文擬根據編碼創傷弧菌gryB 的基因保守序列，設計RPA 檢測的引物對，將一條人工構建的擴增內標引入RPA 檢測體系，以克服上述假陰性的問題，建立一種適用于現場快速檢驗創傷弧菌的技術方法，并測試其特異性和靈敏度[8-10]。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

標準菌株:創傷弧菌（ATCC27562）、腸炎弧菌（ATCC17802）、擬態弧菌（ATCC33653）、河流弧菌（ATCC33809）、溶藻弧菌（ATCC17749）、霍亂弧菌（ATCC39315）、哈維弧菌（ATCC33842）、沙門菌（ATCC14028）、大腸埃希菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）和單增李斯特菌（ATCC19114），采購自美國MBL 公司、中國科學院水生生物研究所和廣東食品微生物安全工程技術研究開發中心；擴增內標質粒和引物來源于生工生物工程（上海）股份有限公司；電泳級瓊脂糖、DNA Marker 及顯色劑來源于寶生物工程（大連）有限公司；RPA 擴增試劑盒為 TwistDX 公司產 TwistAmp Basic Kits；核酸提取試劑盒購自天根生化科技有限公司（批號:DP302）；本次試驗樣品來源于汕頭海關技術中心2018年法定和委托檢驗中的留樣。

2.2 主要儀器與設備

主要儀器與設備見表1。

表1 實驗儀器設備

2.3 方法

（1）核酸樣本提取依據相關規定要求將上述標準菌株進行復壯增菌及生化鑒定，再按照天根生化科技有限公司核酸提取試劑盒（批號:DP302）要求提取樣本中的核酸，樣本核酸濃度和純度的測定由核酸蛋白分析儀檢測并統一稀釋為100 ng/μL 備用。

（2）引物設計RPA 引物設計根據試劑盒中的要求，查閱Gen Bank 公布的gryB 基因的保守序列(KC821520.1)，利用Oligo V6.22 軟件進行其引物的設計和選擇再利用Primer Blast (NCBI 官網)進行其特異性的確認，其合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其最終設計檢測創傷弧菌的RPA 引物擴增條帶234 bp，具體序列如下:上游引物:5′-GCTTGAATACCACCTTCATACATGAAGTGATC-3′；下游引物:5′-TCATGGTGTGCCTGATGCACCGCTTG CTAT-3′。

（3）擴增內標制備原始序列272 bp 來源于Genbank 登錄號為 DQ452569.1，且標題為 Sus scrofa beta actin (ACTB) gene,partial cds 中 489-760 的一段序列，將序列2 端人為添加對應檢測弧菌的RPA引物序列（上游原始序列及下游反向互補序列），交由上海生工進行基因合成，將質控合格的質粒凍干粉稀釋到 10 ng/μL 備用。

具體所用擴增內標序列（334 bp）如下:

GCTTGAATACCACCTTCATACATGAAGTGATC GTTCGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGG CCATCCAGGCGGTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGGC CGCACCACTGGCATCGTGATGGACTCCGGAGACG GGGTCACCCACACGGTGCCCATCTACGAGGGGTA CGCCCTGCCCCACGCCATCCTGCGTCTGGACCTGG CTGGCCGGGACCTGACCGACTACCTCATGAAGATC CTGACGGAGCGGGGCTACAGCTTCACCACCACGG CCGAGCGGGAGATCGTGCGGGACATCAAGGATAG CAAGCGGTGCATCAGGCACACCATGA

（4）RPA 擴增以（1）中提取的核酸為母板，采用（2）中合成的引物進行RPA 擴增，以一級水為陰性對照，實驗溫度為37℃、擴增為40 min。RPA 擴增體系的配制方法具體參照周廣彪等人[11]發表的《重組酶聚合酶擴增技術（RPA）檢測擬態弧菌》中RPA 檢測方法的建立。

（5）RPA 擴增內標用量確認采用10 倍梯度稀釋法對從創傷弧菌標準菌株中提取的核酸進行稀釋，依次稀釋成5 個梯度濃度，并以稀釋的核酸作為測試的母板。分別添加20 ng 和10 ng 共2 個內標用量，按照（4）所示的RPA 檢測反應體系進行擴增內標用量實驗。

（6）方法特異性評價按照前述建立的RPA-IAC檢測反應體系，特異性測試時模板核酸均使用100 ng，擴增內標用量 10 ng，RPA 擴增 40 min，對前述 11 種標準菌株的基因組核酸進行檢測，評價建立的RPA-IAC 檢測方法特異性。

（7）RPA-IAC 檢測方法靈敏度評價采用 10 倍梯度稀釋法對從創傷弧菌標準菌株中提取的核酸進行稀釋，依次稀釋成5 個梯度濃度，并以稀釋的核酸作為測試的母板，按照（4）所示的RPA-IAC 檢測反應體系進行靈敏度實驗，能見到明顯條帶的最低濃度梯度即為RPA-IAC 檢測體系靈敏度。

（8）RPA-IAC 應用效果測試將創傷弧菌標準菌株進行活化，取1mL 活化后的菌液按10 倍梯度進行稀釋，根據其麥氏度推測細菌濃度，再將稀釋液加入魚糜中制備成梯度為106～100cfu/g 的測試樣本，再將測試樣增菌后提取核酸，使用建立的RPA-IAC方法測試應用檢測效果。

3 結果

3.1 擴增內標用量及RPA-IAC檢測方法的靈敏度

擴增內標RPA 檢測方法的用量，檢測結果詳見圖1。其中，創傷弧菌模板量依次為 100 ng、10 ng、1 ng、0.1 ng、0.01 ng。圖1左為擴增內標的用量為 10 ng時不干擾擴增，靈敏度與不添加內標時相同；圖1右為20 ng 有抑制低模板量的目標基因擴增，說明內標用量選擇10 ng 合適。RPA 檢測方法設定為恒溫37℃、反應時間40 min、模板核酸含量為0.1～100 ng時，其234 bp 的目標條帶可以檢測的到；當核酸含量為0.01 ng 時，其234 bp 的目標條帶未顯示，說明RPA 檢測的下限為0.1 ng。

圖1 gryB 基因RPA-IAC 檢測內標用量時靈敏度測試結果

3.2 RPA-IAC檢測方法的特異性評價

研究結果顯示，參試菌株均能檢測到334 bp 的內標基因擴增片段，創傷弧菌還能夠擴增到234 bp的特異性條帶，其他10 株標準菌株均未檢測到目標基因gryB 234 bp 的產物，說明該方法具有較強的特異性（圖2）。

圖2 gryB 基因的RPA-IAC 特異性檢測結果

3.3 RPA-IAC檢測方法應用效果評價

在制備魚糜中添加濃度為106～100cfu/g 的創傷弧菌標準菌株，先行增菌培養8 h 再采用建立的RPAIAC 方法進行檢測，結果顯示，濃度為 106～101cfu/g 時均可被檢出，濃度為100cfu/g 的魚糜樣品未檢出。結果表明，RPA-IAC 檢測方法具有良好的檢測低限，能夠實現在創傷弧菌含量較低的水產品中進行快速檢測。

4 討論

本研究表明，在與β-actin 基因片段為擴增內標對照，以創傷弧菌基因gryB 為檢測基因，純培養條件，擴增內標存在的情況下，創傷弧菌的gryB 基因檢測靈敏度為0.1 ng。結果表明，RPA-IAC 檢測方法與常規PCR 檢測方法具有相當的鑒定效果。

采用擴增內標 PRA 技術來檢測水產品中的創傷弧菌，選用 gryB 基因的原因主要考慮:（1）gyrB 基因在細菌內普遍存在；（2）編碼DNA 促旋酶B 亞基單位蛋白,且不顯現頻繁的基因橫向轉移，具有很強的特異性。

對樣品進行增菌培養，在食品增菌液中，尤其是肉類食品中混有蛋白質、脂肪、表面活性劑等可影響和抑制RPA 擴增及Taq 酶活性。這些雜質很難除去，會導致假陰性的檢測結果，引入β-actin 基因片段作為RPA 檢測的內標擴增對照，在反應體系中，只有內標出現，而沒有目的條帶，則為檢測陰性，如果內標和目的基因條帶均沒有出現，提示整個RPA反應受到雜質的抑制，檢測為假陰性，需要重新檢測一次。可見內標的引入可以有效防止假陰性結果導致的檢測污染，從而提高RPA 檢測的準確度。

擴增內標的選擇對實驗的特異性有著至關重要的作用，是判斷實驗假陰性的重要指標，本文的擴增內標選擇緣由如下:（1）初始片段大小限定為272 bp，這樣原始序列連接所需的上下游引物序列可構建300 bp 左右的擴增內標，適于配套 100～500 bp 大小目標基因，適配范圍廣、參照性好）。（2）β-actin 基因為常用內參基因，由375 個氨基酸組成，分子量大小為 42～43 kDa。β-actin 基因在多個物種之間均有穩定、豐富表達，但在不同物種之間高度保守。（3）從遺傳距離規避以及操作污染防范方面考慮，選擇家豬物種的β-actin 基因為基礎序列構建擴增內參也是比較科學的，因為這樣與目標相似菌群和人類基因組的DNA 均不存在同源性[12,13]。

5 結語

以β-actin 基因為內標基因，gryB 為目標基因，建立的創傷弧菌RPA-IAC 檢測方法具有簡便、快捷、靈敏、高效等顯著優勢，適應于基層和現場檢測，具有較好的應用前景。