6-芐氨基嘌呤預處理對糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的干預效果及機制

鄒 悅 李金容 唐興江

(西南醫科大學附屬醫院神經內科，四川省瀘州市 646000，電子郵箱：573760533@qq.com)

腦卒中是全球第2大死亡原因[1]，具有高發病率和高致殘率的特點。缺血性卒中是腦卒中常見的類型，是中樞神經系統最常見的腦血管疾病之一。目前，組織纖溶酶原激活劑是治療缺血性卒中最有效的方法之一，但其治療時間窗狹窄，禁忌證和并發癥較多，因此臨床上只有一小部分患者從中獲益。研究表明缺血性腦卒中發病機制復雜，主要的機制有鈣離子超載、炎癥因子釋放、氧化應激、線粒體自噬、細胞凋亡等。最近有學者提出，先天免疫誘導缺血后炎癥反應，在腦缺血再灌注損傷中扮演重要角色，而NOD樣受體熱蛋白結構域3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3)是其中一個重要的潛在靶點。

6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)是一種植物激素，也叫細胞分裂素，其在植物中的主要功能包括調控細胞周期、分化、分裂和衰老。動物實驗結果顯示，6-BA對小鼠卵巢、小腸、腦、肝臟等具有抗氧化應激、抗脂質過氧化的作用[2-5]。本研究探討預處理6-BA對糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織NLRP3和白細胞介素(interleukin,IL)-1β表達的影響，為進一步探究6-BA腦保護作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠100只，周齡6～7周，體重220～250 g，由西南醫科大學城北動物實驗中心提供，使用許可證：SYXK(川)2018-065，生產許可證：SCXK(川)2018-17。飼養于清潔動物房，用普通飼料喂養，飲用自來水，自然光照，室溫22℃～25℃。

1.2 試劑和儀器 6-BA購自合肥博美生物科技有限責任公司(批號：2016122011；100 mg/瓶)，用0.06 mol/L鹽酸配制成1 000 mg/L、2 000 mg/L的6-BA儲備液備用。兔抗大鼠NLRP3多克隆抗體(英國Abcam公司，批號：ab214185)，兔抗大鼠IL-1β多克隆抗體(英國Abcam公司，批號：ab16502)，鏈脲佐菌素(美國Sigma公司，批號：20170508c5)，脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒(美國Roche公司，批號：11684817910)，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZLL-9033)。微量血糖儀(長沙三諾生物傳感股份有限公司，型號：2015709723)，光學顯微鏡(日本Olympus公司，型號：CX-21)，熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號：IX51)。

1.3 動物模型制備及預處理

1.3.1 糖尿病大鼠模型的建立：參考林心君等[6]的方法制作糖尿病大鼠模型。采用高脂高糖飼料喂養大鼠4周，4周后用腹腔注射低劑量的鏈脲佐菌素2次，25 mg(kg·m2)，間隔2 d，第5周采用微量血糖儀測大鼠隨機血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型造模成功。

1.3.2 動物分組：采用隨機數字表法將糖尿病大鼠分為4組，包括假手術組、對照組、低劑量6-BA組、高劑量6-BA組，每組25只。

1.3.3 藥物干預：成功建立糖尿病大鼠模型后，在建立大腦中動脈阻斷模型前7 d，低劑量6-BA組、高劑量6-BA組大鼠分別給予20 mg/kg、40 mg/kg的6-BA灌胃，假手術組和對照組大鼠用等量的0.06 mol/L鹽酸灌胃,1次/d,連續給藥7 d。

1.3.4 缺血再灌注損傷模型的建立：采用改良Longa法[7]建立大腦中動脈阻斷缺血再灌注損傷模型。用10%水合氯醛(0.3 mg/kg)腹腔麻醉大鼠后，將大鼠仰臥固定，取頸部正中切口，分離并暴露右側頸總動脈及頸內、外動脈，結扎頸總動脈及頸外動脈根部。在低劑量6-BA組、高劑量6-BA組、對照組大鼠的頸總動脈近分叉部5 mm處，剪一“V”形小口，插入魚線(長50 mm，直徑0.26 mm，于18 mm處做標記)，感到有輕微阻力時即停止插入，插入深度為(18.0±0.5)mm，結扎并固定插線，縫合皮膚，阻斷血流2 h后，拔出魚線進行再灌注。假手術組只需要暴露出頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，不結扎、不插入魚線，其余步驟與其他3組一致。實驗過程如有大鼠死亡，按相同條件給予補充。

1.4 觀察指標 分別于再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，每組各取5只大鼠進行神經功能缺損評分，然后處死大鼠取腦組織檢測NLRP3、IL-1β的表達情況，計數大鼠腦組織海馬CA1區梗死灶細胞凋亡數。

1.4.1 神經功能缺損評分：采用Garcia評分[8]對大鼠自主運動、體態對稱性、前肢伸展功能、網屏實驗、身體雙側觸覺、雙側胡須反射情況進行評分，總分3～18分，得分越高說明神經功能損傷越輕。

1.4.2 腦組織NLRP3、IL-1β的表達：采用免疫組化法測定大鼠腦組織NLRP3、IL-1β的表達情況，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。在高倍鏡下計數每張切片梗死灶NLRP3、IL-1β陽性細胞數，陽性細胞為胞核呈棕黃色的細胞，共觀察5個視野，取均值。

1.4.3 細胞凋亡檢測：采用TUNEL染色法檢測海馬CA1區梗死灶細胞凋亡情況，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。熒光顯微鏡下凋亡細胞的胞核為綠色熒光，高倍鏡下計數每張切片海馬CA1區梗死灶5個視野的陽性細胞數，取均值。

1.5 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1 4組大鼠Garcia評分比較 在各時間點，假手術組、高劑量6-BA組、低劑量6-BA組、對照組的Garcia評分均依次降低(均P<0.05)，見表1。

表1 不同時間點4組大鼠Garcia評分比較(x±s，分)

注：各時間點，與假手術組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05；與低劑量6-BA組比較，△P<0.05。

2.2 4組大鼠腦組織NLRP3及IL-1β的表達水平比較 在各時間點，假手術組、高劑量6-BA組、低劑量6-BA組、對照組的NLRP3及IL-1β陽性細胞數均依次升高(均P<0.05)，見表2～3。

表2 4組大鼠腦組織NLRP3陽性細胞數比較(x±s，個/視野)

注：各時間點，與假手術組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05；與低劑量6-BA組比較，△P<0.05。

表3 4組大鼠腦組織IL-1β陽性細胞數比較(x±s，個/視野)

注：各時間點，與假手術組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05；與低劑量6-BA組比較，△P<0.05。

2.3 4組大鼠海馬CA1區凋亡細胞數比較 在各時間點，假手術組、高劑量6-BA組、低劑量6-BA組、對照組的海馬CA1區凋亡細胞數均依次增加(均P<0.05)，見表4。

表4 大鼠海馬CA1區凋亡細胞計數(x±s，個/視野)

注：各時間點，與假手術組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05,與低劑量6-BA組比較；△P<0.05。

3 討 論

近年來，隨著人們生活方式的改變，以及生活質量的提高，糖尿病患病率也逐漸增加，而糖尿病是缺血性腦卒中發病的獨立危險因素，糖尿病患者并發腦梗死的危險性是未患糖尿病者的2～5倍[9]。有研究證實，糖尿病對腦血管疾病的損傷機制包括以下幾個方面：(1)高血糖加重血管內皮細胞的損傷[10]，促進血管基質蛋白的非酶氧化反應，使得脂質代謝受到一定程度的影響，加速動脈粥樣硬化的發生和發展[11-13]；(2)高糖可激發體內氧化應激狀態，刺激活性氧的產生[14]，明顯增加腦血管疾病的患病風險。6-BA具有穩定、安全、廉價和易于使用的優點，不僅具有抗氧化應激、抗脂質過氧化的作用，可能還有抗炎、抗凋亡等作用。張自強等[4]發現，6-BA對小鼠腦組織氧化損傷具有一定的保護作用。而在高糖合并腦組織損傷的狀態下，6-BA是否可以發揮腦組織保護作用，鮮見有相關研究。因此，本研究觀察6-BA預處理對糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血區NLRP3、IL-1β表達的影響，為進一步探討其在腦缺血再灌注損傷中的腦保護作用具有一定的現實意義。

炎癥反應是腦缺血再灌注損傷的機制之一，在腦缺血再灌注早期，機體會釋放出大量的炎癥因子，如IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子α、C反應蛋白等，可進一步加重腦組織的損傷。抑制炎癥因子釋放和上調抗炎因子的表達，是治療腦缺血再灌注損傷的方法之一。IL-1β是參與炎癥反應的主要促炎因子，主要來源于活化的小膠質細胞，在協調有效的先天性和適應性免疫中扮演重要角色，可激活吞噬細胞、上皮細胞、內皮細胞等進一步促進炎癥細胞因子的表達，從而加重局部炎癥反應[15-16]。

NLRP3屬于胞質內模式識別受體，激活后可形成NLRP3炎性體，在腦組織損傷過程中，NLRP3炎性體可促進IL-1β的產生，加重炎癥反應，不利于損傷腦組織的修復[17-18]。有研究表明，多種外源性及內源性因素，如感染、組織損傷、代謝失調、胞外三磷酸腺苷、乙酰透明質酸、Aβ原纖維、尿酸晶體等，均可激活NLRP3形成NLRP3炎性體[19]。還有研究顯示，活性氧、細胞內鉀離子外流和溶酶體破裂釋放組織蛋白B可能是NLRP3被激活形成NLRP3炎性體的主要模式[20]。而腦缺血再灌注后，大量活性氧的產生可誘導氧化應激，促進鈣離子釋放，鉀離子外流增多，三磷酸腺苷生成減少，NLRP3被激活形成NLRP3炎性體，炎癥反應級聯放大。抑制NLRP3的表達，減少NLRP3炎性體的形成，從而減輕炎癥反應，是減輕腦缺血再灌注后腦組織損傷的途徑之一。

本研究結果顯示，在各時間點，假手術組、高劑量6-BA組、低劑量6-BA組、對照組的Garcia評分依次降低，而NLRP3及IL-1β陽性細胞數依次升高(均P<0.05)，提示6-BA可能通過抑制NLRP3的表達從而下調IL-1β的表達，減輕炎癥反應，起到保護腦神經元細胞的作用。其機制可能是6-BA可以清除氧自由基，從而抑制NLRP3被激活形成NLRP3炎性體，減少炎性細胞因子、黏附分子的產生，減輕腦組織水腫及神經功能損傷。有學者指出，NLRP3可以增加胱天蛋白酶1的作用從而導致細胞凋亡，而胱天蛋白酶-1也可以促使參與糖酵解過程中的一些酶失去活性，導致細胞失去生物活性后死亡[21]。本研究結果還顯示，在各時間點，假手術組、高劑量6-BA組、低劑量6-BA組、對照組的海馬CA1區凋亡細胞數依次增加(均P<0.05)，提示6-BA可能通過抑制NLRP3表達，下調胱天蛋白酶-1、IL-1β的表達，從而減輕腦梗死后水腫周圍組織神經細胞的凋亡，起到腦保護作用。

綜上所述，6-BA預處理可減輕腦缺血再灌注后糖尿病大鼠的炎癥反應，促進大鼠的神經功能恢復，6-BA可能通過下調NLRP3的表達從而減少IL-1β生成及神經細胞凋亡，減輕炎癥反應，起到腦保護作用。