荔枝核總黃酮對大鼠結直腸癌前病變的影響▲

盧 青 成秋宸 肖緒華 范麗雯

(1 桂林醫學院附屬醫院醫院感染管理科，廣西桂林市 541000，電子郵箱：18577956626@163.com；2 廣西醫科大學第一附屬醫院感染科，南寧市 530021)

異性隱窩灶(aberrant crypt foci,ACF)和腺瘤是結直腸癌兩個重要的早癌階段[1]。ACF是目前結直腸癌發生過程中能在光鏡下觀察到的最小且最早期的結直腸黏膜病變，被認為是腫瘤癌變前期病變。結直腸癌的發病機制至今尚未闡明，亦缺乏針對性的藥物治療。多項研究結果提示ACF可用來評價化合物和食品的抗癌和致癌作用以及相應機制[2-3]。本課題組前期采用荔枝核總黃酮(total flavone ofsemenlitchi,TFL)體外干預人結直腸癌細胞株HT29，發現TFL具有抑制HT29細胞系增殖的作用，對相關分子通路的蛋白也有抑制作用[4]。本研究建立經典ACF癌前病變大鼠模型，再給予TFL灌胃，探討TFL對大鼠結直腸癌前病變的抑制作用，以及對ACF中程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1,PD-1)、核因子-кB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)p65基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只成年雄性Wistar大鼠，體重150～180 g，無特定病原體級，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK桂2009-0002。適應性喂養1周，喂養環境溫度(25±1)℃，濕度60%～80%，自由進食飲水，光照12 h/d。

1.2 藥品與試劑 二甲肼購自Sigma公司(批號：#BCBQ2802V)，使用前用生理鹽水配成2%的濃度，用NaHCO3調整pH值至6.5左右。TFL購自南京草本源生物科技有限公司(批號：ZC16081016)，純度83.5%。谷胱甘肽測試盒購于南京建成生物工程研究所(批號：A061)。總RNA提取試劑盒購自中國康為公司(批號：CW0581)；反轉錄試劑盒HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper) 購自南京諾唯贊公司(批號：R223-01)；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑購自南京諾唯贊公司(批號：Q311-02)。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 儀器 SZX10型解剖鏡購自日本奧林巴斯公司，qTOWERE 2.2熒光定量PCR儀購自德國AnalytikJena公司，F200 PRO酶標儀購自瑞士Tecan Infinite公司，D3024R型冷凍離心機購自美國SCILOGEX公司，Tone 96G梯度PCR儀購自德國Analytik Jena公司，K5500型微量分光光度計購自北京凱奧科技發展有限公司。

1.4 建模及干預方法 將40只大鼠按照隨機數字表法分為對照組、模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組，每組10只。制備大鼠ACF模型[5]：除對照組外，按照20 mg/kg的劑量給予其他組大鼠皮下注射二甲肼，對照組只注射等劑量生理鹽水，均1次/周，連續注射15周。在首次給予二甲肼處理后第2天起，對照組、模型組給予5 mL/(kg·d)的生理鹽水灌胃，TFL小劑量組、TFL大劑量組分別按100 mg/(kg·d)、200 mg/(kg·d)給予TFL灌胃，1次/d，直至實驗第15周最后1 d，應用放血法處死大鼠。

1.5 ACF計數 取大鼠全部結直腸，并將腸組織沿腸系膜縱向切開，0℃磷酸緩沖鹽溶液洗凈，黏膜面朝上置于10%中性甲醛液中固定48 h。然后表面均勻噴灑0.2%的亞甲藍溶液，將染色10 s后的腸組織于10倍放大的解剖鏡下觀察并計算ACF的數目。ACF判斷標準：鏡下見腺管開口明顯擴大、上皮細胞層增厚，腺管之間間距增大，不規則的管腔，鏡下可見輕微的隆起。

1.6 血清酶學檢測 收集大鼠全血5 mL置于促凝管，4℃ 3 500 r/min離心10 min分離出血清，按照試劑盒說明書進行血清谷胱甘肽的檢測。

1.7 mRNA水平檢測 取大鼠ACF組織約5 mg，對照組取非ACF的腸道組織5 mg，應用RNA保存液凍存，加TRIzol在冰上勻漿裂解，按照總RNA提取試劑盒(柱式法)提取總RNA，使用無酶水將RNA從提取柱上洗脫，RNA微量定量儀測定濃度及純度，采用反轉錄試劑盒將500 ng RNA反轉錄為cDNA。去除基因組DNA，將模板和上下游引物均稀釋10倍后進行熒光定量PCR反應，反應體系為20 μL(SYBR Green Master Mix 10 μL，10 μM引物1 10.5 μL,10 μM引物2 20.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7 μL)，PCR反應條件：預變性95℃ 30 s，變性95℃ 10 s，退火55℃ 15 s，共反應39循環，延伸72℃ 20 s。每個樣本重復3次，同步設立空白對照。以β-肌動蛋白為內參，引物序列見表1。利用2-△△CT計算目的基因相對表達量，△CT=CT目的基因-CT內參基因。

表1 引物序列

1.8 統計學分析 使用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用TamhaneT2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 4組大鼠ACF計數比較 模型組大鼠結直腸出現直徑約5 mm的ACF，對照組大鼠結直腸未發現有ACF病變。模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組大鼠ACF的數量依次下降(均P<0.05)，見表2。

表2 4組大鼠ACF計數及血清谷胱甘肽含量比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與TFL小劑量組比較，△P<0.05。

2.2 4組大鼠血清谷胱甘肽含量比較 模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組、對照組大鼠血清谷胱甘肽含量依次升高(均P<0.05)，見表2。

2.3 4組PD-1、NF-κBp65 mRNA的表達水平比較 模型組ACF中PD-1 mRNA的表達水平高于對照組及TFL大劑量組(P<0.05)，其余組間差異均無統計學意義(均P>0.05)。與對照組比較，模型組NF-κBp65 mRNA的表達水平升高，而TFL大劑量組的表達水平下降(均P<0.05)；模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組NF-κBp65 mRNA的表達水平依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠ACF組織中PD-1、NF-κB p65 mRNA的相對表達水平比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與TFL小劑量組比較，△P<0.05。

3 討 論

我國是結直腸癌的高發國家，每年新發病例超過25萬，死亡病例約14萬，均占全世界同期相應病例的20%左右[6]。研究表明，早期癌癥患者治療后5年生存率可提高到90%以上，而晚期結直腸癌患者術后5年生存率只有12%[7]。如何早期發現并處理病變，預防結直腸癌的發展是迫切需要解決的重大問題。近年來，天然植物中的抗腫瘤有效成分及其相關機制成為研究熱點之一。

抗氧化劑抗腫瘤的機理主要通過抑制腫瘤相關基因和蛋白質表達，抑制脂質過氧化，減少腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，以阻止腫瘤的發生、轉移、惡化。黃酮類化合物是一類具有2-苯基色原酮結構的化合物，是自然界廣泛存在的一種較強的抗氧化劑[8]。黃酮類化合物除了具有清除自由基和抗氧化作用外，還可抗病毒、抗腫瘤及雙向調節細胞凋亡[9]。TFL是從傳統中藥荔枝核中提取的黃酮類化合物的總稱，是荔枝核中抗氧化的最主要成分。目前，尚缺乏有關TFL在腫瘤發生中作用的研究。本研究中，模型組大鼠結直腸出現直徑約5 mm的ACF，提示使用二甲肼成功建造大鼠直腸癌癌前病變模型。給予一定劑量的TFL進行干預后，模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組大鼠ACF的數量依次下降(均P<0.05)，提示TFL可抑制大鼠結直腸出現ACF，且大劑量的TFL作用更佳。前期實驗結果表明TFL有抑制體外HT29細胞增殖的作用[4]，因此，我們推測TFL對結直腸癌前病變的產生有一定的抑制作用。

谷胱甘肽可保持細胞膜結構的完整性及組織細胞免受損傷，反映了機體清除氧自由基的能力。有研究表明，黃芪總苷通過降低肝微粒體代謝酶CYP450的含量，提高谷胱甘肽活力，從而抑制大鼠結直腸ACF的形成[10]。亦有研究表明，七葉亭和七葉苷可抑制二甲肼引起的結腸DNA氧化損害過程，從而抑制ACF的產生[11]。本研究中，模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組大鼠血清谷胱甘肽含量依次升高(均P<0.05)，提示TFL在該模型中發揮了較好的抗氧化作用，且大劑量的TFL作用更佳。可見，作為一種強抗氧化劑，TFL具有減少ACF的作用,從而防止其進一步發展導致結腸癌發生。

NF-κB通路在結腸從炎癥到癌變的過程中發揮極其重要的作用。炎癥時脂多糖與Toll樣受體4特異性結合后，下游NF-κB信號通路被激活：當NF-κB從細胞質轉移到細胞核內，即被激活，隨后進一步激活其他基因，引起細胞增殖，抑制細胞凋亡[12]。與NF-κBp50組成二聚體的NF-κB p65是NF-κB信號通路中的關鍵節點，NF-κBp65主要參與基因轉錄的起始調節。研究證實，當細胞受到腫瘤壞死因子、白細胞介素等外界因素刺激時，NF-κBp65從二聚體上解離而活化，持續活化的NF-κBp65可改變細胞正常的信號傳導，促進細胞癌變[13]。而在腫瘤細胞中，NF-κBp65可促進腫瘤細胞的增殖，抑制腫瘤細胞的凋亡，促進血管新生，參與細胞外基質降解，提高腫瘤細胞的浸潤轉移能力[14]。我們在前期研究中發現，TFL對HT29細胞系有抑制其增殖的作用，且發現TFL干預后NF-κB mRNA和蛋白的表達均顯著降低[4]，提示TFL通過干預NF-κB的轉錄和翻譯過程來抑制HT29細胞增殖；且當NF-κB被抑制后其下游的白細胞介素1β表達亦減少，提示NF-κB可能為TFL抑制HT29細胞系增殖的關鍵因子。在本研究中，模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組NF-κBp65 mRNA的表達水平依次降低(均P<0.05)，提示TFL可降低二甲肼誘導的大鼠ACF中NF-κBp65 mRNA的表達，據此推斷，TFL通過抑制NF-κBp65基因的表達來抑制大鼠早期結直腸腫瘤發生。

PD-1是在結直腸癌發病機理中參與免疫逃逸的關鍵基因。然而僅TFL大劑量組ACF中PD-1 mRNA的表達水平低于模型組(P<0.05)，而TFL小劑量組與模型組差異并無統計學意義(P>0.05)，TFL沒有顯示出較好的作用，可能是出于腫瘤早期尚未激活PD-1信號通路來促進腫瘤的生長。

綜上所述，TFL對二甲肼誘導的大鼠結腸癌前病變具有良好的抑制作用，大劑量TFL的作用更佳；NF-κBp65可能為TFL抑制大鼠結直腸ACF發生、發展的關鍵因子，或可成為抑制腫瘤發生的潛在靶點。TFL可作為預防結直腸早癌的潛在藥物，其機制需更進一步探索和研究。