2種因素對蘭州百合繼代組培苗生長的影響

段四喜，徐春蓮，湯王外，和壽星*

(1.大理市農業環境保護監測站，云南 大理 671000；2.云南省農業科學院 高山經濟植物研究所，云南 麗江 674100)

蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)川百合的變種，為多年生鱗莖草本植物，有很高的食用、藥用、保健和觀賞價值[1,2]。采用組織培養進行百合的快速培養和脫毒復壯，可促進百合商品種球的生產和百合新品種的培育[3-5]。其中，不定芽誘導的多少是影響植株組織培養的關鍵因素[5,6]。但是在初代誘導結束以后，有無不定芽產生會對蘭州百合繼一代試管苗產生怎樣的影響尚未見報道。

在蘭州百合組培中往往將組培分為初代、繼代和生根3個階段[7,8]。其中，繼代培養是植物組織培養過程中的重要環節，也是離體保存種質資源的重要手段。該階段通常需要連續多代的培養，在整個組培過程中占據的比例大、周期長[9-13]。在此階段如果激素(尤其是NAA和6-BA)濃度過高或者過低，均會嚴重影響組培苗的生長發育；但若兩者濃度和比例適宜，則可實現外植體的快速繁殖[5,8,14]。在百合繼代培養中NAA和6-BA濃度范圍一般在0.1～1.0 mg/L[14-16]。隨著離體培養技術的發展，很多學者發現多種植物組培苗在長期繼代保存過程中增殖能力和生根能力會發生變化[10,17,18]，例如：卷丹[11]、東方百合[19]、龍牙百合[20]等繼代培養3次時組培苗分化和長勢最好，最有利于移栽，之后隨著繼代次數的增加鱗莖分化率不斷下降；杜捷等[12]發現蘭州百合繼代培養5次以后無分化能力。但上述學者都僅局限于研究繼代頻次數對百合組培苗分化和長勢的影響，并未引入在這一動態過程中激素濃度是否有必要適當調整的研究。截止目前，僅有本課題組就蘭州百合繼一代和繼二代的激素濃度需要適時調整做過相關研究[14]，但在后續繼代培養過程中，激素濃度是否需要適當調整等并未有相關研究。因此，如何既能最大限度根據不同的繼代頻次調整激素濃度，又可以使組培苗快速健康的生長是目前生產需要解決的關鍵問題。基于此，本試驗的目的一是探討在繼一代組培中初代有無不定芽產生對試管苗生長的影響；二是在最佳繼代次數3次時，使NAA和6-BA濃度在0.1～1.0 mg/L范圍內，繼續探討不同繼代次數激素濃度的調整對試管苗生長發育情況的影響，旨在提高蘭州百合再生植株的效率，為種質資源的保存奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

于2017年4月在云南省農業科學院高山經濟植物研究所組培室進行鱗片組織培養。

1.2 試驗材料

1.2.1 材料 蘭州百合鱗莖采集于麗江市龍山鎮，供試材料鱗片保持完好，抱合緊密、健壯、無病斑、色澤光亮、無機械損傷，鱗莖盤無損壞。

1.2.2 培養條件 先在4 ℃冰箱中保存40 d，之后采用固體MS 培養基，培養基中蔗糖30 g/L，瓊脂6.5 g/L，pH 值5.8，根據試驗材料添加其他物質，121 ℃高壓滅菌25 min。接種后放到培養室中培養，培養溫度為(25±2) ℃，日光燈光源，光照強度2000 lx，光照時間16 h /d。

1.3 試驗方法

1.3.1 初代有無不定芽產生對繼一代生長的影響 在初代接種30 d后，篩選出初代未污染的外植體，設3個處理，各處理激素濃度如表1所示，同時將每個處理都分為有不定芽產生和無不定芽產生兩處理，每瓶接種4個點，每處理接種30瓶，重復3次。接種后15、18、25、28 d觀察并記錄未污染外植體獲得率、轉綠率和死亡率。

1.3.2 不同激素濃度對繼一代蘭州百合生長的影響 在初代最優培養基MS+1.0 mg/L NAA +0.1 mg/L 6-BA中(已有前期結果[14])，將有不定芽產生的試管苗進行切割，每瓶接種4個點，設3個處理，各處理激素濃度如表1所示，每隔一段時間觀察記錄初代有不定芽產生3個處理的生葉率、死亡率和小鱗莖個數，接種33 d后統計葉片數和小苗株數。

1.3.3 不同激素濃度對繼二代蘭州百合生長的影響 在繼一代最優培養基中，篩選出長勢基本一致的試管苗，剪除葉片，將其進行切割，每瓶接種4個點，接種于繼二代的3個處理中，各處理激素濃度如表1所示。每隔一段時間觀察記錄繼二代的發芽率、生葉率、葉片數和不定芽個數。

1.3.4 不同激素濃度對繼三代蘭州百合生長的影響 在繼二代最優培養基中，篩選出長勢基本一致的試管苗，剪除葉片，將其進行切割，每瓶接種4個點，各處理激素濃度分別如表1所示。接種后30 d觀察生葉率、發芽率、葉片數和不定芽個數，篩選出最適宜的繼三代培養基。

表1 不同繼代次數的激素濃度 mg/L

1.3.5 相關計算公式 未污染外植體獲得率(%)=(未污染外植體個數/外植體接種總數)×100%。

外植體存活率(%)=(未污染且存活的個數/外植體接種總數) ×100%。

外植體轉綠率(%)=(轉綠個數/未污染的外植體總數) ×100%。

外植體發芽率(%)=(發芽的個數/未污染的外植體總數) ×100%。

外植體生葉率(%)=(長葉個數/未污染的外植體總數) ×100%。

1.4 統計分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS軟件統計分析數據。

2 結果與分析

2.1 初代有無不定芽產生對繼一代生長的影響

由圖1～圖3可知，在繼一代培養中，有無不定芽兩處理未污染外植體獲得率、轉綠率和死亡率3個指標差異均顯著。有不定芽產生處理的外植體獲得率、轉綠率遠高于無不定芽產生處理，死亡率則遠低于無不定芽產生處理。在繼一代培養結束后，無不定芽產生處理3個激素濃度組合死亡率均為100%，有不定芽產生處理則為A處理死亡率稍高達到19.02%外，其于兩個處理死亡率均較低。

在15～28 d范圍內，兩處理未污染外植體獲得率變化均較平緩，尤其在繼一代培養的后期(25～28 d)污染率不再增加。就外植體轉綠率情況而言，在接種后15～25 d范圍內A處理有無不定芽兩處理間無顯著差異，而B和C兩處理間差異顯著，有不定芽產生處理遠高于無不定芽產生處理，但在接種后期(接種后28 d)差異不顯著。

圖1 初代有無不定芽產生對繼一代未污染外植體獲得率的影響

圖2 初代有無不定芽對繼一代外植體轉綠率的影響

圖3 初代有無不定芽對繼一代外植體死亡率的影響

2.2 不同激素濃度對蘭州百合繼一代生長的影響

由表2可知，3個激素濃度處理間各時期生葉率、死亡率、小鱗莖個數和葉片數差異顯著，長勢變化幅度較大。就生葉率而言，在接種后13～20 d時A處理稍強，接種后23～33 d，B處理稍強。在接種后20 d 3個處理在不同程度上都呈現死亡現象，死亡率表現為A>C>B。在接種后13 d 3個處理間小鱗莖個數差異不顯著，接種20～33 d后差異均顯著，為B>A>C；接種33 d后，盡管3個處理葉片數間差異不顯著，但是葉片數以B處理稍多。綜合而言，在繼一代培養中以B處理(MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA)的激素濃度最有利于蘭州百合生長發育，其次為C處理，而A處理稍差(圖4)。

表2 不同激素濃度對繼一代蘭州百合生長的影響

注：“/”表示此指標沒有統計。下同。

圖4 激素濃度對繼一代苗長勢的影響(接種后20 d)

2.3 不同激素濃度對繼二代蘭州百合組培苗的影響

由圖5可知，試管苗生葉率基本呈現正態分布，接種后7～17 d生葉率快速增多，17～38 d變化平緩，38～44 d急劇下降。除接種后34 d為A>B>C外，在各階段生葉率均呈現B>A>C。從接種后7 d開始發芽率不斷的下降，在38～44 d急劇下降，各階段發芽率均表現為C>A>B。由表3可知，3個處理葉片數和不定芽數有差異但不顯著，除接種后44 d葉片數和不定芽數為B稍大于A外，其余均為A>B>C。繼二代蘭州百合培養以A(MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA)為最適培養基，其次為B，而C處理相對較差(圖6)。

表3 不同激素濃度對繼二代蘭州百合生長的影響

2.4 不同激素濃度對繼三代蘭州百合組培苗生長的影響

由表4可知，繼三代各階段生葉率始終遠高于發芽率。3個處理生葉率C最高，發芽率C最低，生葉率和發芽率均為C與A和B兩處理差異顯著，而A和B間差異不顯著。各處理葉片數間差異不顯著。不定芽個數除接種后31 d差異顯著，為C>A>B外，其余各階段在接種后不同時期無顯著差異。繼三代處理6-BA濃度在0.25～0.50 mg/L范圍內波動時，A和B兩處理生長發育情況基本一致，6-BA濃度的變化對百合鱗片的增殖擴繁影響甚微。因此，在繼三代培養中以C處理(MS+0.1 mg/L NAA+0.75 mg/L 6-BA)為最適培養基，而A和B處理長勢接近，暫不能區分何種激素濃度為適宜培養濃度(圖7)。

圖5 激素濃度對繼二代生葉率和發芽率的影響

圖6 激素濃度對繼二代苗長勢的影響

3 討論與結論

初代有無不定芽產生與繼一代試管苗存活有很大的關系，初代培養30 d后，無不定芽產生處理一般可認定為死亡[9,21-22]。盡管在繼一代培養中，初代無不定芽產生處理接種后有轉綠現象出現，且轉綠率在最高時可達42.86%，但是在本試驗條件下，3種激素濃度處理均不會再產生不定芽，繼一代培養結束后(接種后33 d)完全死亡。這進一步說明，初代培養30 d左右后，無不定芽產生處理一般可認定為死亡。因此，在篩選繼一代培養材料時，應挑選初代已產生不定芽的材料，以提高試管苗的存活率。

表4 不同激素濃度對繼三代蘭州百合生長的影響

圖7 激素濃度對繼三代苗長勢的影響(接種后35 d)

在百合的組織培養研究中已經證實6-BA和NAA濃度水平是百合不定芽能否產生的關鍵因素[5,8,14]，在其增殖時對激素濃度也有不同的要求[23]。本課題組前期研究結果也表明繼一代培養基以MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA為最佳培養基，繼二代以MS+0.1 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA為適宜培養基[14]。但本試驗研究結果表明繼一代和繼二代分別以MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA和MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA為適宜培養基。誘導培養33 d后，最佳繼一代培養基生葉率、小鱗莖數和葉片數分別為69.52%、6.67個和14.50片，但死亡率僅為13.02%；最佳繼二代培養基生葉率、葉片數和小鱗莖數在最高時分別達到91.18%、21.00片和7.67個；與前期研究結果相比，本試驗繼一代培養基NAA濃度提高5倍，6-BA濃度卻降低了2倍；繼二代NAA濃度不變，6-BA濃度卻提高2倍。這可能與前期試驗均從上一代中篩選長勢一致的試管苗進行下一代組培擴繁，而本試驗在上一代最優培養基中篩選出長勢基本一致的試管苗進行下一代組織培養有關。這可能導致植物本身內源激素的水平不同，另外內源激素又隨植物組織的部位以及生長期等條件而變動，從而改變各處理所需的適宜激素水平，這進一步說明不同外源植物生長調節劑水平顯著影響植物的生長發育[24,25]，但具體機理有待于進一步研究探討。繼三代培養以MS+0.1 mg/L NAA+0.75 mg/L 6-BA為最佳培養基，生葉率和發芽率在各階段均為100%和0.00%，而6-BA濃度為0.25、0.50 mg/L的兩處理對不同激素水平表現不敏感，這一方面應與繼代后期體細胞無性系變異有關，另一方面應與激素濃度過低，芽的生長受到抑制有關[26-28]。