CRISPR-Cas9系統在蔬菜育種上應用研究進展

暴會會，尹竹君，王少坤，馬瑞紅，謝俊俊，張 杰，楊正安*

(1.云南農業大學 園林園藝學院，云南 昆明 650201；2.玉溪市澄江縣經濟作物工作站，云南 玉溪 652599)

基因定點編輯是研究基因功能的重要手段之一。鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)和類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)都能使DNA靶位點產生DNA雙鏈斷裂(DSB)進而實現基因組定點編輯[1-2]。ZFN和TALEN通過蛋白質和DNA識別發揮作用，CRISPR-Cas 9通過一小段RNA序列來識別DNA，具有設計簡便、高效、可實現高通量操作的特點[3]。比較而言，ZFN制備復雜、成本昂貴,而TALENs對每一個基因位點的編輯都需要重新設計、合成和組裝2個核酸酶，載體構建復雜，技術難度大，制約了其應用。2013年,CRISPR/Cas9技術逐漸成熟，只需合成一個sgRNA即可對基因特異性修飾、操作簡單、作用高效[4]。目前，CRISPR-Cas9系統在基因編輯方面發展迅速，已成功應用于幾種蔬菜作物，如番茄、馬鈴薯、油菜和甘藍等。本文主要對CRISPR-Cas9技術和以番茄為主的蔬菜作物應用研究及未來發展方向進行了綜述。

1 CRISPR-Cas9系統

1987年，日本微生物學家石野良純(Yoshizumi Ishino)等在大腸桿菌的基因組研究中發現一段特殊串聯間隔重復序列[5]，至2013年，Li等在《Nature》首次公布了利用CRISPR/Cas9系統在植物體內共表達經密碼子最優化的Cas9和sgRNA，誘導擬南芥(Arabidopsis)和本生煙草(Nicotianabenthamiana)發生特定基因突變，該研究成果第一次證明了sgRNA/pcoCas9系統可以在植物基因組中發揮作用[6]。

1.1 CRISPR-Cas9的類型

細菌和古細菌在長期進化中形成了復雜的CRISPR適應性免疫系統，其根據Cas蛋白及其序列的不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類[7-8]：Ⅰ型中Cas蛋白具有核酸酶、解旋酶活性[9]，特征蛋白是Cas3，主要分布在細菌及古細菌中；Ⅱ型中Cas蛋白N端具有RuvC核酸酶活性結構域，中部具有HNH核酸酶結構域，特征蛋白是Cas9，主要分布于細菌中；Ⅲ型中Cas蛋白主要參與crRNA的成熟和剪切外源DNA[10]。本文主要介紹在化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)中發現的Ⅱ型CRISPR-Cas9系統，其他CRISPR系統雖只需一種crRNA但需多種Cas9蛋白共同參與，Ⅱ型系統需2種RNA(crRNA和tracrRNA)，雖增加RNA數量，卻只需要一種Cas9蛋白完成[11]，相對而言更易操作且不需依賴復雜的蛋白復合物，目前已廣泛應用于蔬菜作物基因組編輯。

1.2 CRISPR-Cas9的原理

CRISPR-Cas9系統介導的細菌適應性免疫反應分為3個階段：(1)噬菌體首次入侵宿主時，Cas基因編碼的蛋白復合物將入侵外源短DNA片段作為間隔序列整合到CRISPR位點的5′端[12]；(2)噬菌體再次侵染該宿主時，CRISPR序列轉錄出CRISPR前體RNA(precursor crRNA,pre-crRNA)，經剪接形成成熟的crRNA，包含多個串聯重復序列和間隔序列，間隔序列具有特異性，可識別外源靶DNA并與之形成堿基互補配對[13-14]；成熟的crRNA與反式激活crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)形成二元復合體，與dsDNA中一條鏈以20 nt特異位點互補配對形成短DNA-RNA復合物[15-18]。另一條DNA鏈形成R環結構[19]。(3)R環形成后，具有2種核酸酶活性Cas9蛋白在與crRNA間隔序列互補的位點切割DNA，在特定位點引入DNA雙鏈斷裂(DSB)[20-22]。在crRNA與DNA靶位點特異性結合時，DNA鏈上必須存在一段PAM序列才能使得結合過程順利進行[23-28]。

1.3 HR修復機制的研究進展

真核生物中，靶向DNA雙鏈斷裂后即在體內啟動2種DNA修復機制，即同源重組修復(homologous recombination，HR)和非同源末端連接修復(non homologous end joining，NHEJ)[29]，其分別導致基因置換或基因敲除。DSB最常被非同源末端連接修復，它可以在破壞基因功能的斷裂位點產生插入/缺失突變，也可以通過同源依賴性修復修復DSB，HR僅在存在同源序列時發生，其修復來自“供體”DNA模板的信息。HR通常在體細胞中發生頻率更低，因為它需將供體DNA分子和序列特異性核酸酶(SSN)表達盒引入植物細胞中[30]。一般通過HR不會改變目標基因編碼序列，但當供體質粒提供同源位點時可插入外源基因片段，HR可以對Cas9蛋白切割的目標DNA序列進行精確編輯。所以，利用DNA修復損傷機制，可實現DNA的插入、缺失，為研究基因功能提供了有效方法。目前，許多科學家成功運用CRISPR/Cas9系統實現植物目的基因敲除。然而，利用該系統成功插入或替換目標片段卻極少報道。研究表明，CRISPR/Cas9系統可以通過HR方式編輯目標片段。盡管HR的效率遠低于NHEJ，但HR能更準確地在目標位點引入新片段。

2014年，Schiml等[31]第一次通過CRISPR/Cas9系統利用HR介導的修復機制成功在擬南芥的ADHI基因位點導入了具有卡那抗性的片段。Cermak等[32]為擴大模板供體序列設計雙生病毒系統，成功在番茄中導入卡那抗性片段，促進HR修復途徑精確編輯。Endo等[33]研究發現DNA連接酶V參與NHEJ修復途徑，可通過抑制DNA連接酶V促進CRISPR/Cas9系統插入或替換目標片段。近來有文獻報道，發現當質粒和自由雙鏈DNA形態都存在的情況下，提供HR供體能夠提高植物同源重組修復效率。相反，單鏈寡核苷酸則不能通過提供HR供體而發揮功能[34]。研究表明，通過同源定向修復(HR)的CRISPR/Cas9誘導的基因置換為產生具有延長貯藏壽命的番茄品系提供了有價值的方法[35]。

2 CRISPR/Cas9技術的應用

CRISPR/Cas9系統是植物基因組編輯的一種新興技術。CRISPR-Cas9有效基因組編輯一般包含4個步驟:(1)設計和構建基因特異性sgRNA;(2)sgRNA的活性在原生質體中驗證；(3)通過土壤農桿菌將CRISPR-Cas9系統遞送到植物細胞；(4)基因分型鑒定[36]。

2.1 植物多重基因編輯的研究進展

CRISPR/Cas9系統允許多個sgRNA同時表達，實現植物多重基因編輯[37]。有研究結果表明，如果使用單個gRNA，則大多數是NHEJ修復不會導致突變。因此，用2種及以上gRNA是實現定向誘變更有效方法[30]。研究者通過連續循環克隆將含有不同目的片段sgRNA插入二元載體中或利用多重限制性內切酶以產生不同粘性末端將sgRNA插入不同位點[38-39]。Zhang等構建了含有Cas9和6個gRNA表達基因序列的載體，證明CRISPR/Cas9系統能夠同時編輯6個目標基因位點[40]。2015年，Wang等利用同尾酶和限制酶技術實現了水稻中3個基因的同時編輯[41]。Ma等利用Golden Gate克隆水稻CRISPR/Cas9系統二元結構，經單一循環克隆實現了8個位點插入、7個類似FT的基因同時突變[42-43]。

目前已經開發了幾種同時表達多種gRNA的系統，通常涉及組裝多個單獨的gRNA表達盒，由單獨的RNA聚合酶Ⅲ(Pol Ⅲ)啟動子轉錄[44-45]。通過RNA切割酶將這種多順反子mRNA在轉錄后加工成單個gRNA。這些酶包括來自銅綠假單胞菌的CRISPR相關RNA內切核糖核酸酶Csy4[46]，天然存在于宿主細胞中的tRNA加工酶和核酶[47]。無論位置效應如何，證實Csy4是多重基因編輯的最有效系統，而且能夠同時使多達12個gRNA在植物中創建多重靶向基因缺失[30]。

2.2 脫靶突變應對策略研究

CRISPR/Cas9是一種功能強大的基因組編輯系統，但不受控制的Cas9核酸酶表達會觸發脫靶效應甚至體內免疫反應。Cas9蛋白結構、特異位點堿基數、GC堿基含量、溫度等方面都會影響編輯效率，增加CRISPR-Cas9系統的特異性是一項重大挑戰。目前已有以下幾種策略可以解決這個問題：(1)Slaymaker等對Cas9蛋白結構進行了優化，利用部分中性氨基酸替代原有正電荷氨基酸[48]。(2)Mikami[49]和Fauser[50]等發現，增加Cas9的切口酶活性能減少脫靶效應。配對的切口酶已被證明在植物中具有最小的脫靶效應[51]。(3)Hu等通過使用噬菌體輔助連續進化(PACE)快速獲得具有最廣泛PAM兼容性的進化的SpCas9變體xCas9。與野生型Spcas9相比，xCas9-3.7和xCas9-3.6大大降低了脫靶率[52]。(4)Shen等[53]設計了一種合成開關(結合Cas9/gRNA靶向并抑制cas9基因轉錄，以及L7Ae∶K-turn系統抑制Cas9 mRNA翻譯)，用于在轉錄和翻譯步驟中嚴格控制Cas9表達，以最小化脫靶效應而不犧牲靶上誘變頻率。可見，CRISPR-Cas9系統的特異性、有效性將是該技術發展和應用的關鍵點。相信隨著科學技術的發展，基因編輯技術將更加精確、效率更高，在我國蔬菜育種發展進程中做出重要貢獻。

3 CRISPR/Cas9在蔬菜育種上的應用研究進展

3.1 番茄育種

科學家應用CRISPR/Cas9系統實現目標基因編輯，改進番茄重要農藝性狀，如產量、品質、抗病性、抗脅迫能力，還可以研究番茄基因功能及其分子機制解析。2013年，Jiang等[54]在番茄等研究中，證明了CRISPR/Cas9系統可以短期應用于植物基因組編輯。

3.1.1 產量和品質 2018年，Li等[55]在《Nature》發表成果，通過多重CRISPR-Cas9編輯花、果實以及抗壞血酸合成相關的基因的上游開放閱讀框，編輯植株的后代具有馴化表型，且保留了親本抗病性和耐鹽性。同時，Zs?g?n等[56]利用CRISPR-Cas9策略，使用多種gRNA串聯的Csy4陣列，展開針對番茄產量、生產力等6個重要基因座編輯，實現了野生番茄從頭馴化。該研究成功編輯了6個靶向基因座中的4個(SP、O、FW2.2、CycB)，基因編輯后植株的果實其大小增加了3倍，果實數量增加了10倍，番茄紅素提高了500%。番茄PROCERA基因編碼DELLA蛋白，功能喪失突變抑制了生長，Tomlinson等[57]使用CRISPR/Cas9和sgRNA靶向PROCERA DELLA結構域，雜合子在幼苗期顯示出中間表型，成熟后與純合子一樣矮小。Li[58]、Nonaka[59]等利用CRISPR/Cas9有效地增加了番茄果實中γ-氨基丁酸的含量。D’Ambrosio等[60]利用CRISPR/Cas9技術靶向類胡蘿卜素生物合成的2個關鍵基因Psy1、CrtR-b2，結果證明：CRISPR-Cas9系統是可以在番茄中產生有用突變的有效且快速的方法，可以在育種計劃中實施。Li等[61]通過人工引入含有多個sgRNA表達盒的轉化載體，增加番茄紅素的含量，成功應用pYLCRISPR/Cas9多靶點編輯系統，在番茄類胡蘿卜素合成和代謝途徑中產生許多相關基因突變，為獲得具有改良農業性狀的新番茄品種提供了基礎。

3.1.2 抗性 Nekrasov等[62]通過使用CRISPR/Cas9技術獲得對白粉病真菌病原體具有更高抗性的番茄植物。Ortigosa等[63]通過CRISPR/Cas9介導的SlJAZ2編輯產生抗細菌性果斑病的番茄品種。Manal等[64]用Cas9-sgRNA靶向番茄黃葉曲葉病毒(TYLCV)基因組產生了有效病毒干擾，研究結果證實CRISPR/Cas9系統在番茄耐TYLCV工程中的有效性，并為其他作物中對單個和多個感染性病毒工程抗性研究奠定基礎。Li等[65]利用CRISPR-Cas9系統生成番茄slcbf1突變體，與野生型(WT)相比，slcbf1突變體表現出更嚴重的冷害-損傷癥狀，有助于更好地了解SlCBF1調節番茄冷害敏感性分子基礎。通過將CRISPR-Cas9技術運用到蔬菜作物遺傳改良育種，成功獲得相應抗性蔬菜作物成為可能。

3.2 其他蔬菜作物上的應用研究

Murovec J等[66]利用CRISPR-Cas9首次報道了甘藍(B.oleraceaL.)和大白菜(B.rapaL.)2種內源性報告基因(PDS)中RNPs的定點誘變，以及vernalization dedet FRIGIDA (FRI)基因的誘變，獲得了較高突變頻率。Sun等[67]首次采用CRISPR/Cas9系統實現了中國羽衣甘藍基因組定點編輯；還實現了用于同時突變多基因以產生各種突變材料的單個靶位點，結果強化了CRISPR/Cas9系統在栽培蕓薹屬蔬菜中的應用，豐富了我們對蕓薹屬作物中CRISPR/Cas9突變模式的認識，為進一步研究基因功能奠定基礎。Andersson等[68]利用CRISPR/Cas9技術敲除馬鈴薯(Solanumtuberosum)合成直鏈淀粉的唯一酶[顆粒結合淀粉合成酶(GBSS)]消除直鏈淀粉形成。GBSS基因的高效率敲除顯示了CRISPR-Cas9 RNP(ribonucleoprotein)技術作為未來馬鈴薯育種方法的潛力。Braatz等[69]使用CRISPR-Cas9在四倍體油菜(Brassicanapus)中靶向2種ALCATRAZ(ALC)同源物。敲除ALC增加抗破碎性，避免機械收獲期間的種子損失。4個等位基因僅使用一個靶序列在單個T1植物中突變。這證明了CRISPR-Cas9介導的基因組編輯在多倍體物種中同時修飾不同同源基因拷貝的潛力。Sun等[70]結果表明，CRISPR/Cas9系統在甘藍型油菜中產生具有高抗核盤菌性的種質，BnWRKY70可以作為負調控菌核抗性的調節因子起作用。Yang等[71]利用CRISPR/Cas9系統對油菜CLV信號通路中的3個關鍵基因進行了高效敲除，并進行穩定轉化，BnCLV3的雙突變產生可遺傳的多室角果，并增加種子產量。CRISPR/Cas9系統可推進油菜功能基因組研究，推動育種進程。

4 結語與展望

隨著CRISPR-Cas9系統的不斷改進、優化以及新的Cas系統出現，應用范圍將更廣泛，在基因功能研究和應用上發揮更大作用。目前，番茄雜交制種仍以人工去雄為主，一直以來花粉不育型和雄蕊退化型保持較困難，盡管花藥發育機理已在擬南芥和水稻中開展了大量的研究工作，但有關番茄花藥和花粉發育調控相關機理的深入研究卻報道較少。本課題組在前期工作成果的基礎上進一步把CRISPR-Cas9系統應用于番茄雄性不育中，通過克隆分析花粉壁合成相關基因，利用該技術獲得成功轉化的番茄，再經過轉錄組、蛋白組數據分析，獲得花粉花藥相關基因的調控網絡，用以探索創制番茄雄性不育新方法。除了上述基因組工程應用，值得注意的是Cas9系統在下一代測序(Next Generation Sequencing,NGS)領域的革命性應用。使用Cas9系統，可以去除99%以上在測序文庫中具有高豐度的冗余序列[72]，且不受輸入樣品量的限制。CRISPR與NGS技術結合的另一個應用是短串聯重復(STR)-Seq。其實現了跨越靶向微衛星位點的DNA片段的富集，并且通過NGS對超過2000個STR進行測序和并行分型。目前降低其脫靶效應和提高同源重組(HR)編輯效率是實現我國基因精準定點編輯的重要一步。總之，CRISPR/Cas9系統經過不斷改進與完善，將在蔬菜作物遺傳育種中發揮更大作用。