應用分子標記輔助選育洋蔥不育系及其雜交應用

楊海峰，惠林沖，陳 微，李威亞，何林玉，郇國磊，王江英，徐衛平，李景芳，繆美華，陳振泰，潘美紅

(1.連云港市農業科學院，江蘇 連云港 222000；2.江蘇省云臺農場有限公司，江蘇 連云港 222000)

洋蔥(AlliumcepaL.)是世界上重要的蔬菜品種之一，日本、韓國、美國等國家早已開展洋蔥雜交種選育。目前國內主要是常規種選育，雜交種選育也在探索中。洋蔥生育周期長，跨越3個年度，常規育種選育周期長；在雜交育種中主要利用洋蔥細胞質雄性不育系(CMS，cytoplasmic male sterility)進行雜交配組，選育對應的保持系，擴繁所需時間至少10年以上。隨著分子生物技術的發展與應用，國內外高校、科研院所等機構開始對洋蔥細胞質雄性不育進行分子標記研究，首次在洋蔥品種‘Jaune paille des Vertus’[1]和‘Italian Red’[2]中分別發現了CMS-T和CMS-S兩種細胞質雄性不育類型。利用DNA分子標記已開發出能夠通過PCR鑒定出洋蔥可育與不育株，以及不育株不育類型，如利用cob[3]標記能夠區分CMS-S型，orfA501[4]標記在洋蔥不育株中擴增出473 bp條帶，與cob標記相結合可以區分洋蔥可育株N、CMS-S和CMS-T；利用Cp-cytotype[5]、cob-type2和atp6[6]標記都能鑒定CMS-S型，但不能區分正常可育株N和CMS-T；利用orf725[7]和Cpp1[8]能夠將洋蔥3種類型完全區分開。不育系標記的開發能夠在配組的F1苗期鑒定出不育株，從而確定父本是否是對應的保持株，加快不育系的選育進程。

同時，與洋蔥保持系育性相關的分子標記也已被開發出來，jnurf13[9]、AcSKP1[10]、DNF-566、RNS-357[11]、OPT和PsaO[12]均為與育性Ms位點相關的分子標記，從中篩選出jnurf13適合作為保持系鑒定的分子標記[13]。可以在田間大量篩選出優秀的保持株，混合雜交選育穩定的保持系，擴繁對應的不育系，縮短保持系的選育周期，為雜交制種提供親本材料。本課題圍繞洋蔥不育系的選育，選育出101A、A1、A3、D-9和T 5份不育系材料，通過分子標記驗證或分子標記輔助選育，為雜交品種的選育提供豐富多樣的母本材料。利用101A(5001)為母本育成具有高產、綜合性狀優良的自主雜交品種連蔥096[14]，配制大量雜交組合，篩選優良父母本材料。洋蔥可食用器官為地下鱗莖，與水稻、小麥、玉米、大豆等其他植物可食用器官不同，生產中種植戶不需要采收種子，對洋蔥育種提出新的思路：洋蔥全不育型雜交種的選育，2014年開始利用優良不育系與父本(保持系)進行雜交，篩選組合，為洋蔥育種奠定材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源及特征

試驗材料全部來自于連云港市農業科學院蔬菜研究室中日照洋蔥，101A和101B、D-9和d-9、A1和a1、A3和a3、T和t分別為相配套的不育系和保持系，5套不育系材料的引種名稱、來源、單位和時間見表1，分別編號為1～5號；2018年新引進14份雜交種，2016年自主選育2份全不育型雜交種A1×3C和T×912，共計16份材料，于2018年10月全部利用orf725分子標記在苗期進行育性驗證，材料特點見表2。以黃皮洋蔥的不育系A1和D-9為母本，配制64份雜交組合，分別編號為22～85號。

表1 洋蔥不育材料的來源及特點

表2 2018年新引進中日照洋蔥雜交種材料

1.2 試驗方法

試驗材料在連云港市農業科學院蔬菜試驗基地種植，取洋蔥苗期葉片，液氮保存，用DNA試劑盒(型號：DP350-03)提取洋蔥基因組DNA，引物由蘇州金唯智生物有限公司合成(表3)，PCR擴增試劑購置于TAKARA公司，反應體系為25 μL，包括：2 μL DNA(0.1 μg)，2.5 μL 10×PCR buffer，1.25 μL(10 μmol/L)正向引物，1.25 μL(10 μmol/L)反向引物，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.25 μL TaqM和15.8 mL ddH2O，cob(s)、cob(n)和orf725的PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min[13]。jnurf13的PCR反應條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，65 ℃(每循環遞減0.8 ℃)退火30 s，72 ℃延伸1 min，10個循環；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min[9]。cob(s)、cob(n)、orf725的PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，jnurf13的PCR產物采用9%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電壓100 V，電泳3 h，硝酸銀染色，采用佳能EOS6D相機在膠片燈上拍照記錄。

洋蔥雜交種配制于2016年10月至2018年6月進行，以A1和D-9兩份不育系材料為母本進行雜交組合配制，種球行間距15 cm×35 cm，父母本按照1∶3的行數進行配比，每個制種小區6 m2，采用防蟲網進行全封閉隔離，在開花期采用蒼蠅輔助授粉。2017年9月將收集的洋蔥雜交種播種育苗，洋蔥苗定植行間距15 cm×15 cm，每個小區32 m2，重復3次。試驗小區隨機排列，同大田正常管理。

1.3 數據處理

取每小區對角線上3點，每點隨機選取20株，于2018年3月29日開始調查統計洋蔥田間生長情況，記錄膨大期、倒秧期、植株長勢、葉片姿勢、葉片數、假莖粗；2018年5月23日采收后，調查洋蔥球顏色、球形、球形指數、單球重；采收后分別測3小區產量。

表3 洋蔥分子標記引物

2 結果與分析

2.1 洋蔥不育系分子標記輔助選育

2.1.1 101A不育系的選育及特征 101A不育系主要通過田間配組選育，2003年形成穩定的不育系，通過cob(s)和cob(n)分子標記進行育性驗證，1號和2號為可育株101B，3號和4號為不育株101A，2號和4號為cob(n)引物PCR擴增，cob(n)標記結果顯示在180 bp均有條帶，說明101B(1號、2號)和101A(3號、4號)是可育或T型細胞質不育；1號和3號為cob(s)引物PCR擴增，cob(s)標記結果顯示只在3號中有414 bp大小條帶，說明101A(3號)為CMS-S型不育(圖1)。洋蔥雄性不育系101A株高85 cm左右，功能葉10～13片，鱗莖的假莖粗1.2 cm左右，鱗莖表皮棕黃色，圓球形，單球重200～300 g，晚熟(圖2)。

2.1.2 不育系A1和D-9的選育及特征 2003年從日本引種秀玉丸玉蔥，2005年從韓國引進DSD-001，經多代自交篩選，2009年5月中下旬在2個品種留種田中分別發現15株(52個花序)和20株(70個花序)不育株，當年分別在同一品種中用可育株與不育株花序隨機配組，可育株部分套袋自交；2009年8月下旬分別對可育株和自交父本進行塑料大棚小株留種法播種；2010年3月通過orf725分子標記對F1苗期進行不育株鑒定，部分檢測結果如圖2，1、2、3號為秀玉丸玉蔥(d-9)可育單株自交，4、5、6號為DSD-001(a1)可育單株自交，7、8、9號為1、2、3號父本與秀玉丸玉蔥不育株雜交F1(D-9)，10、11、12號為4、5、6號父本與DSD-001不育株雜交F1(A1)；結果顯示orf725能夠在可育株(1～6和12號)中擴增出一條833 bp；在7～11號中擴增出833 bp和628 bp兩條帶，為CMS-T型不育株(圖3)，所以1～3號為d-9保持株，7～9號為D-9不育株，將分子標記鑒定出的D-9和d-9分別混合擴繁；4和5號為a1，10和11號為A1，a1和A1分別混合擴繁，6號和12號則淘汰。2010年9月中旬將收獲的種子播種，2011年5月底收獲種球及9月定植，2012年7月收獲種子，同年9月播種，2014年7月收獲種子，經3代擴繁于2014年形成穩定的不育系A1和D-9。

不育系A1的基本特性：早熟，生長勢旺，植株直立，7～8片管狀葉，株高55～65 cm。生育期為230 d左右。鱗莖圓球形，假莖較細，球型指數0.85左右，平均單球重190 g，球形整齊。平均產量為64500 kg/hm2。商品性好，外皮黃色，有光澤，有甜味，在自然存儲中腐爛率和發芽率低(圖4A)。

不育系D-9基本特性：早熟，生長勢旺，植株直立，7～8片管狀葉，葉片蠟粉多，株高60～70 cm。生育期為225 d左右。鱗莖圓球形，假莖較細，蔥球頂部偏平，球型指數0.75左右，平均單球重180 g，球形整齊。平均 產量為67500 kg/hm2。商品性好，鱗片包裹緊密，外皮黃色，有光澤，有甜味，抗病能力強(圖4B)。

圖2 洋蔥101A的田間表現

圖4 A1和D-9不育系田間采收

2.1.3 不育系A3和T的選育及特征 2005年從日本引進早春黃3號，2010年選育出紅皮406，經過多代群體選擇，形成穩定的優良資源，2015年5月洋蔥開花初期在留種田中發現早春黃3號和紅皮406分別有8株和13株不育株，去除已開的花朵，套袋防止其他花粉污染，同時分別在同一品種中收集可育株150株，利用jnurf13分子標記對可育株DNA進行篩選，3 d內完成保持系的篩選。jnurf13分子標記可以用于區分MsMs、Msms、msms3種類型，能夠在含有Ms位點中擴增出241 bp，在含有ms位點中擴增出229 bp，在含有Msms中能擴增出兩條帶，在早春黃3號150株中有19株含有一條229 bp的條帶，為保持株(a3)(部分電泳圖，圖5A)，與8株不育株集中隔離授粉；同樣在406中篩選出18株保持株(t)(部分電泳圖，圖5B)，與13株不育株集中隔離授粉。2015年8月上旬分別對兩份材料F1播種(塑料大棚小株留種法)，11月通過orf725分子標記對F1苗期隨機取30份樣進行不育株鑒定，檢測結果100%不育。2016年7月收獲種子，8月上旬采用大棚小株留種方法播種，父母本按1∶3種植，2017年7月上旬收獲種子，于2017年形成穩定的不育系A3(早春黃3號)和T(406)。

2017年9月初播種，2018年5月收獲洋蔥種球(圖6)，不育系A3的基本特性：早熟，黃皮，生長勢旺，植株直立，管狀葉細長，株高55～65 cm。生育期為235 d左右。鱗莖長圓球形，假莖較細，球型指數0.90左右，平均單球重210 g，球形整齊。平均產量為67500 kg/m2。商品性好，外皮黃色，有光澤，辛辣味濃(圖6A)。不育系T的基本特性：中熟，紫皮，扁球形，生長勢旺，植株直立，管狀葉細長，株高70～80 cm。生育期為250 d左右。假莖較細，球型指數0.70左右，平均單球重240 g，球形整齊。平均產量為75000 kg/m2。商品性好，皮色紫，有光澤，辛辣味濃(圖6B)。

圖6 A3和T不育系田間采收

2.2 洋蔥雜交種組合篩選

以A1和D-9兩份不育系材料為母本進行63份雜交組合配制，于2016年10月開始將配組種球進行定植，2017年4月隔離網隔離，蒼蠅輔助授粉，7月收獲F1種子，9月播種育苗，2018年5月進行采收。在表4中有16個雜交組合 平均產量達75000 kg/hm2以上，葉片直立向上，長勢旺，圓球形，適合高密度栽培，有利于提高產量。在黃皮洋蔥中40號(D-9×745)、39號(D-9×562)和23號(A1×3C)產量相對較高，分別達到92545.5、91294.5、83166.0 kg，23號的產量雖然在這3個材料中不高，但膨大期為4月2日，比39、40號要早10 d，倒秧期要早4～5 d，為早熟材料，同時父本3C是通過分子標記篩選出來的保持系，為全不育型雜交種；39號和40號的產量都達到90000 kg/hm2以上，39號材料葉片生長姿勢為半直立向上，而40號為直立向上，更適合密植，在生產中產量有進一步提高的空間。紅粉皮洋蔥72號(D-9×912)、73號(A1×912)和84號(D-9×911E)的產量分別達到79630.5、82852.5、84600 kg/hm2，3個材料的膨大期和倒秧期基本一致，葉片生長姿勢直立向上，都屬于中晚熟類型，72和73號的鱗莖球是圓形，84號為扁圓形。

表4 洋蔥雜交一代田間性狀統計

續表1:

2.3 洋蔥雜交種育性分子鑒定

為鑒定目前市場上中日照洋蔥雜交種的育性，選取14個國內外主栽品種與2個自主選育品種，每個品種中隨機取17株利用orf725對其單株DNA進行分子標記，結果顯示16份品種中只有6號帝皇、17號紅將軍、20號A1×3C和21號T×912 4個全部擴增出833 bp和628 bp兩條帶，為CMS-T型不育株(圖7)，均為全不育型雜交種，其他12份材料為可育株。

圖7 洋蔥雜交種育性PCR鑒定結果

3 討論

目前，分子標記輔助選擇不育系已直接應用于植物育種中，如水稻[15]、小麥[16]、甘藍型油菜[17]和玉米[18]等。在洋蔥育種中細胞質雄性不育系是解決雜交制種問題最有效的途徑之一，自洋蔥CMS-S[2]和CMS-T[1]被鑒定以來，開發了Cp-cytotype[19]、cob[3]、atp6和cob-type，orf501[4]，orf725[7]和Cpp1[8]許多不育相關分子標記，以及ACms.1100[19]、jnurf05和jnurf17[20]、jnurf12和jnurf13[9]、OPT和PsaO[12]、WHR240[21]、PMS1[22]、DNF-566和RNS-357[11]、Ms[24]等與Ms[23]位點相關標記并應用于生產中。我國洋蔥育種研究起步晚，常規選育不育系耗時長，21世紀以來分子標記的應用加快了我國洋蔥不育系及雜交種選育進程。本團隊通過分子標記選育了穩定的A1、D-9、A3和T，配制的優良雜交種已在生產中應用；洋蔥保持系分子標記的開發能夠在優良的父本中篩選出保持系，保證洋蔥雜交種的純度，為全不育型雜交種選育奠定了豐富的材料基礎，可直接應用于生產。

國內中日照洋蔥雜交品種還很少見報道，大多數引進韓國、日本的雜交種。以本課題組選育的兩個黃皮洋蔥的不育系A1和D-9為目標，進行群體雜交，23、39、40、72、73和84號為候選雜交組合，23號為黃皮早熟全不育型雜交種，市場急需早熟中日照品種彌補空缺；40號葉片長勢直立，產量較高，為中晚熟品種。在粉紅色洋蔥中，84號雖然為偏扁球形，但在市場中還占有一定的分量，在江蘇及周邊中日照洋蔥栽培地區，紅皮扁球形逐步被紅皮圓球形代替，但有些消費者習慣紅色扁球洋蔥。根據近幾年洋蔥種子市場需求發現，球形基本以圓球形為主，紅皮洋蔥中，以皮色深紫色為主，進口的洋蔥雜交種中，多數為紅粉色為主，產量雖然比國內常規種高，但是農戶利潤低，如本課題組選育的常規種連蔥11號(紫玉88，蘇鑒洋蔥201501，中晚熟、高球形、深紫色)[24]，蔥球市場批發價要比國外雜交種高，且種子供不應求。雜交組合中72、73和84號產量雖然較高，但從市場角度看，粉紅色并不是最受歡迎；而全不育型雜交種的開發能夠解決皮色、品種保護問題，2018年新引進的14個和本課題組2個雜交種中，通過分子標記苗期檢測，帝皇、紅將軍、A1×3C和T×912為全不育雜交種。在甘藍型油菜雜交種中利用分子標記輔助篩選恢復系，可以提高選育獲得強優勢雜交組合的效率[25]，所以在今后洋蔥雜交育種中，利用分子標記輔助篩選優良保持系、不育系和全不育型雜交組合將成為主流方向。