T790 M及COX-2在晚期非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI耐藥中的臨床研究

徐 丹 王于理 李 晶 鞏 平 李瑞陽 袁 野

1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 (新疆 石河子 832000) 2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 (新疆 石河子832000)

多項(xiàng)研究表明，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI)是EGFR突變的晚期非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。然而，絕大多數(shù)患者在服藥6～12月后均出現(xiàn)EGFR-TKI的獲得性耐藥，而T790 M突變是最主要的獲得性耐藥機(jī)制[1-2]，此外，前列腺素合成通路上的關(guān)鍵酶環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)亦可直接或間接影響著腫瘤進(jìn)展[3]。因此本研究以EGFR突變陽性的晚期非小細(xì)胞肺癌患者為研究對(duì)象，依據(jù)晚期肺癌患者血清和腫瘤組織EGFR基因突變狀態(tài)檢測(cè)高度一致性的理論[4]，收集接受EGFR-TKI治療前后NSCLC患者的外周血游離DNA，使用探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS法)進(jìn)行T790 M基因檢測(cè)；并使用ELISA法檢測(cè)外周血清中COX-2的表達(dá)，比較EGFR-TKI治療前后有效組及耐藥組的T790 M及COX-2的差異性。本研究旨在尋求有效預(yù)測(cè)EGFR-TKI療效的方法，為提高晚期NSCLC患者生存時(shí)間和生活質(zhì)量提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月—2017年11月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院EGFR陽性突變的晚期非小細(xì)胞肺癌患者60例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)和影像學(xué)確診初次治療的Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者；②年齡25～75歲之間；③KPS評(píng)分≥60分；④治療前血常規(guī)、肝腎功能正常, 無放療、化療禁忌證；⑤既往無其他腫瘤病史，醫(yī)學(xué)原因不能手術(shù)或在技術(shù)上手術(shù)不能切除者及患者放棄手術(shù)治療者；⑥EGFR基因檢測(cè)陽性，并接受EGFR-TKI治療至病情進(jìn)展或無法耐受藥物不良反應(yīng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者病例資料不全或缺失；②病理確診前接受抗腫瘤治療的患者；③對(duì)EGFR-TKI原發(fā)耐藥患者；④治療依從性差的患者。所有患者均在簽署知情同意后采集血樣。本研究已通過石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.2 治療方法

口服吉非替尼(易瑞沙，阿斯利康制藥有限公司，250 mg/d)，直至疾病進(jìn)展或死亡。

1.3 樣本采集和分離及實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 T790 M的測(cè)定：所有患者在影像學(xué)檢查提示病情進(jìn)展或好轉(zhuǎn)后采集清晨空腹靜脈血5 mL，置于帶有血清分離凝膠的離心管內(nèi)，然后3 000 r/min離心10min(r=8 cm)，取上層血清，于抽血后4～5 h按QIA amp Blood Mini Kit試劑盒說明書，提取外周血游離DNA，采用ARMS法進(jìn)行T790 M基因檢測(cè)。

1.3.2 COX-2的測(cè)定：靶向藥物治療前及治療后2個(gè)月采集患者清晨空腹靜脈血3 mL，分離血清，-80 ℃?zhèn)溆谩２捎梦錆h優(yōu)爾生的環(huán)氧化酶-2 ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 療效的評(píng)價(jià)

靶向藥物治療前及治療后2個(gè)月進(jìn)行CT影像學(xué)檢查，按實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) RECIST 1.1版評(píng)價(jià)近期療效，包括完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進(jìn)展(PD)。計(jì)算總有效率=(CR+PR)例數(shù)/總例數(shù)×100%。有效組患者=CR+PR+SD；耐藥組患者=PD。

1.5 隨訪

采用電話隨訪，隨訪截止日期2018年4月30日，至隨訪截止日，失訪1例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，患者臨床病理特征、T790 M基因狀態(tài)與療效之間的關(guān)系采用χ2或Fisher確切概率法檢驗(yàn)；不同療效患者靶向治療前、治療后血清COX-2基線水平的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；血清COX-2水平的變化與療效關(guān)系的分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者臨床病理特征與EGFR-TKI治療后療效的相關(guān)性

58例患者中，CR 0例，PR15例(25.9%)，SD23例(39.7%)，PD20例(34.5%)。疾病RR為25.9%，DCR為65.5%。從女性、腺癌、從不吸煙及ECOG評(píng)分0～1分的層面來看，接受EGFR-TKI治療的總有效率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 患者臨床特征與EGFR-TKI總有效率的相關(guān)性

2.2 兩組患者EGFR-TKI靶向治療前后T790 M基因陽性突變情況比較

在58例患者中，兩組患者治療前T790 M基因陽性突變均較低，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.345)；EGFR-TKI靶向治療后，兩組患者T790 M基因陽性突變均提高(χ2=35.153，P<0.001)；有效組治療前后T790 M基因陽性突變雖然升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.375，P=0.123)；耐藥組治療前后T790 M基因陽性突變升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 001)。見表2。

2.3 兩組患者EGFR-TKI靶向治療前后COX-2水平比較

靶向治療前有效組患者血清COX-2基線水平高于耐藥組患者(t=44.159，P<0.001)，靶向治療后的血清COX-2水平與治療前相比，有效組患者降低(t=36.180，P<0.001)，耐藥組患者升高(t=-17.852，P<0.001)，見表3。

表2 兩組患者靶向治療前后T790 M基因陽性突變情況分析

2.4 EGFR-TKI治療后T790 M基因突變狀態(tài)及COX-2的表達(dá)相關(guān)性

所有標(biāo)本中，T790 M陽性表達(dá)23例，COX-2水平較治療前升高20例，T790 M陽性同時(shí)伴COX-2水平升高18例，Spearman等級(jí)相關(guān)分析示，EGFR-TKI治療后晚期非小細(xì)胞肺癌患者中T790 M基因狀態(tài)分析與COX-2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.747，P<0.001)。見表4。

表3 兩組患者靶向治療前后COX-2水平比較

表4 EGFR-TKI治療后T790 M基因突變狀態(tài)及COX-2的表達(dá)相關(guān)性

2.5 T790 M基因突變狀態(tài)及COX-2水平與PFS的關(guān)系

COX多因素分析顯示，T790 M基因突變狀態(tài)(HR=0.168，95%CI為0.056～0.509，P=0.002)和COX-2水平(HR=0.245，95%CI為0.066～0.911，P=0.036)是影響PFS的獨(dú)立因素，見表5。

表5 患者PFS的多變量COX模型分析

3 討 論

近年來，EGFR-TKI在晚期NSCLC的治療中進(jìn)展迅速，已成為肺癌治療中最有潛力的治療方式。目前國內(nèi)外公認(rèn)大約50%EGFR耐藥是由T790 M突變引起，但是要達(dá)到完全克服TKI獲得性耐藥的目的，單考慮T790 M突變是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，而其它50%的獲得性耐藥機(jī)制還在積極探索中。其中，相對(duì)于正常組織而言，COX-2卻在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且通過誘導(dǎo)腫瘤血管生成、促進(jìn)增殖、抑制凋亡等多個(gè)環(huán)節(jié)參與腫瘤的生成[5]。那么，在NSCLC靶向治療中，血清COX-2水平及T790 M基因狀態(tài)是否能共同影響EGFR-TKI耐藥呢？

EGFR-TKI可以抑制腫瘤的細(xì)胞增殖、血管形成并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。有關(guān)亞洲人種患者亞群的研究中[6]，EGFR-TKI治療腫瘤能夠取得較好的療效。本研究中，58例晚期NSCLC患者服用EGFR-TKI后，總有效率為25.9(15/58)。女性、腺癌、從不吸煙以及服藥前較低的ECOG評(píng)分(0～1分)的患者的總有效率相對(duì)更高。

盡管EGFR-TKI在肺癌治療中效果良好，然而，仍有小部分患者并不能從中獲益，一開始對(duì)EGFR-TKIs治療有效的患者最終也會(huì)因各種原因出現(xiàn)耐藥。杜亞茜[7]等發(fā)現(xiàn)，TKI藥物治療的NSCLC患者樣本中，T790 M的突變率為40.0%，初步表明了繼發(fā)性耐藥的產(chǎn)生與T790 M突變的相關(guān)。有研究[8]對(duì)EGFR基因敏感突變患者經(jīng)EGFR-TKI治療耐藥后的二次活檢分析發(fā)現(xiàn)，T790 M基因突變率較高，進(jìn)而證實(shí)T790 M基因突變是EGFR-TKI獲得性耐藥的重要機(jī)制之一。隨著基因檢測(cè)技術(shù)的提高，丁丁[9]等Meta分析顯示，證明了治療前T790 M水平對(duì)TKI治療具有一定預(yù)測(cè)作用。本研究通過ARMS法檢測(cè)NSCLC患者T790 M突變情況，58例NSCLC患者靶向治療前的T790 M基因總突變率為1.7%(1/58)；TKI藥物治療后，T790 M的突變率為37.9%(25/58)。隨后分別對(duì)兩組患者TKI治療前后T790 M突變分析發(fā)現(xiàn)：兩組患者治療前T790 M基因陽性突變均較低，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.345)；EGFR-TKI靶向治療后，兩組患者T790 M基因陽性突變均提高(χ2=35.153，P<0.001)，故這EGFR陽性T790 M突變患者可能是在使用EGFR-TKI中被誘導(dǎo)出來的。

另外，TKI治療后，有效組與耐藥組T790 M基因陽性突變均升高，有效組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.375，P=0.123)，而耐藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 001)。由此進(jìn)一步證明T790 M基因突變狀態(tài)可有效預(yù)測(cè)EGFR-TKI療效。治療前有效組T790 M 0例，耐藥組1例，因此治療前T790 M突變很可能是EGFR突變陽性患者接受TKI治療的負(fù)性預(yù)測(cè)因子。如果在EGFR-TKI使用前患者就同時(shí)具有T790 M 突變和EGFR的敏感突變，則這一小部分雙突變的細(xì)胞在患者個(gè)體接受EGFR-TKI治療過程中則處于優(yōu)勢(shì)，在僅有EGFR敏感突變的細(xì)胞凋亡的同時(shí)，雙突變的細(xì)胞得以繼續(xù)增長并且逐漸成為主導(dǎo)基因型，在影像學(xué)上體現(xiàn)為原本縮小。即為治療選擇壓力所致。可見治療前T790 M突變的檢測(cè)對(duì)臨床開展和實(shí)施肺癌患者的病情評(píng)估及診療具有重要的臨床意義。

與此同時(shí)，黃建鋒[10]等報(bào)道了EGFR和COX-2信號(hào)通路之間存在著復(fù)雜的相互聯(lián)系和作用, 二者聯(lián)合抑制可能提高HNSCC的治療效果。本研究結(jié)果顯示，EGFR-TKI治療后，血清COX-2水平與治療前相比，有效組患者降低(t=36.180，P<0.001)，耐藥組患者升高(-17.852，P<0.001)。由此提示，晚期NSCLC患者靶向治療的療效與血清COX-2水平有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，于耐藥組患者而言，有效組患者治療前血清COX-2基線水平升高(t=44.159，P<0.001)，提示治療前高水平COX-2可能是靶向治療有效性的一個(gè)信號(hào)。

此外，T790 M陽性突變及COX-2表達(dá)均與腫瘤進(jìn)展有關(guān)。COX多因素分析顯示，T790 M基因突變及COX-2水平是影響PFS的獨(dú)立因素(P<0.05)，EGFR-TKI治療后晚期NSCLC患者中T790 M基因狀態(tài)與COX-2表達(dá)存在相關(guān)性(P<0.001)，但本研究樣本量少，且二者分別受獨(dú)立因素影響，尚需大樣本前瞻性研究進(jìn)一步證實(shí)。總之，T790 M基因突變及COX-2表達(dá)水平在EGFR突變陽性晚期非小細(xì)胞肺癌患者中具有巨大的潛在預(yù)測(cè)價(jià)值；隨著這一研究領(lǐng)域的不斷發(fā)展，動(dòng)態(tài)檢測(cè)T790 M突變狀態(tài)及COX-2水平，有利于及早、及時(shí)評(píng)估患者療效。