多梳基因蛋白EZH2促進喉鱗狀細胞癌血管生成的機制及臨床評價

蘇 娟 吉曉濱 李 鵬 李 雯 謝景華

1 廣州市第一人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科(廣州 510180) 2 廣州市第一人民醫院病理科(廣州 510180)

喉鱗狀細胞癌(1 aryngal squamous cell carcinoma，LSCC)是頭頸部腫瘤比較常見的一種惡性腫瘤，LSCC的發病率、死亡率一直逐年增加，嚴重影響人類的生存質量。癌有血管依賴性，癌組織中豐富的新生血管為腫瘤的生長提供充足的營養成分、氧氣及癌細胞轉移途徑[1]。腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)是目前公認的評估腫瘤血管生成形態學的金標準[2]。血小板-內皮細胞黏附分子31(platelet endothelial cell adhesion molecule-31，CD31)是廣泛應用的新生血管生成標記物，其標記的微血管密度(CD31-MVD)可用于評估腫瘤血管新生，與腫瘤形成、發展、預后密切相關[3]。

果蠅zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)屬于多梳基因蛋白，可促進腫瘤血管生成，在多種腫瘤細胞中呈高表達[4- 6]，是目前腫瘤生物治療研究的新熱點。但迄今關于EZH2在LSCC中表達的研究并不多見，EZH2、CD31與LSCC臨床及預后的關系研究也很少，我們對此作了測定和探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2012年1月—2013年8月就診于廣州市第一人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，并住院行部分喉或全喉切除術的61例LSCC患者的石蠟組織標本。臨床資料齊全，病理明確為LSCC，分化程度明確。術前均未經化療、放療或其他治療。其中男56例，女5例，年齡35～79(60.9±10.8)歲。所有患者均接受術后常規隨訪，主要通過電話、門診復查等形式，隨訪時間≥5年，自確診之日開始，最晚至2018年10月結束。同期正常對照組20例，其中男18例，女3例，年齡在39～75(58.1±8.9)歲。標本來源于接受全喉手術的患者，標本距腫瘤邊緣≥2 cm，病理證實無癌組織。標本由兩位病理醫生雙盲法復查。

1.2 試劑

CD31單克隆抗體、通用型SP免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自美國SantaCruz生物工程有限公司；兔抗人EZH2單克隆抗體購自美國Cell Signaling 公司，二抗購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 實驗方法

標本常規石蠟包埋切片，厚度約4 μm。脫蠟、水化后以3%H2O2室溫孵育10min，消除內源性過氧化物酶活性，熱修復抗原5min。滴加一抗(EZH2為1:50；CD31為1:100)4 ℃孵育過夜。次日加入二抗37 ℃孵育2 h，DAB室溫下顯色。蘇木精復染、脫水、透明、中性樹膠封片。用試劑公司提供的大腸癌組織切片作CD31染色的陽性對照，EZH2以已知陽性乳腺癌組織切片做陽性對照。以PBS緩沖液代替一抗做陰性對照。

1.4 結果判定

CD31-MVD計數：凡被抗體染成棕黃色的內皮細胞、細胞簇作為1個微血管計數，按Weidner[7]法進行，隨機計數5個高倍鏡下微血管數，取平均值作為MVD值。EZH2陽性呈棕黃色染色，主要位于細胞核/胞漿。根據染色強度和細胞數目進行分級。隨機選取5個高倍鏡(×400)下視野取平均值。染色強度：無著色、淡黃色、黃或深黃色、褐或棕褐色分別評為0、1、2、3分；細胞數目：無陽性細胞、陽性細胞<25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別評為：0、1、2、3、4分。兩評分相加：0分為(-)；1～2分為(+)；3～4 分為(++)；5～6分為(+++)，≥3分則為強陽性表達。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件。計數資料采用χ2檢驗、Fisher精確檢驗。計量資料采用t檢驗、秩和檢驗，多組間比較用單因素方差分析。相關性檢驗采用Spearman秩相關分析。Kaplan-Meier生存分析、Log-rank檢驗和Cox比例風險分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CD31的表達

2.1.1 CD31在LSCC和NLT中的表達對比 CD31的陽性表達為棕黃色顆粒，主要集中在腫瘤組織邊緣區的血管內皮細胞,微血管或呈條索狀、或具有管腔，形態不規則，分布不均。而在NLT中微血管形態規則，分布少、較均勻(圖1)。61例LSCC中CD31-MVD值(/0.5 mm2)為10.26±2.46，20例NLT中為1.20±1.10，差異有統計學意義(t=-15.85，P<0.05)。

A CD31在T3期LSCC中的陽性表達；B CD31在T4期LSCC中的陽性表達；C CD31在NLT中的陰性表達；D CD31在NLT中的弱陽性表達圖1 CD31在LSCC和NLT中的表達(SP×400)

2.1.2 CD31-MVD與LSCC臨床病理參數的關系 CD31-MVD與LSCC淋巴結轉移、T分級和臨床分期有關(P均<0.05，見表1)。

表1 LSCC中CD31-MVD、EZH2表達與臨床病理參數的關系

*為連續性校正檢驗結果

續表

臨床病理因素nCD31-MVD(/0.5mm2)MVD(x±s)t/FPEZH2-+陽性率/%χ2P組織學分級 高分化339.55±2.090.8210.4462760.705.500.04 中分化229.86±1.9612165.20 低分化610.67±1.751572.89淋巴結轉移 N0349.32±2.46-3.770.0072759.395.130.04? N+2711.56±2.0812673.38T分級 T178.71±1.804.110.103431.759.200.03 T2139.15±2.1921166.15 T31410.71±2.2321266.71 T42711.19±2.2022571.15臨床分期 Ⅰ78.71±1.804.320.013442.239.600.02 Ⅱ129.17±2.2921065.52 Ⅲ1310.31±1.9721166.15 Ⅳ2911.28±2.2522771.39吸煙指數(每天吸煙支數×吸煙年限) <400289.79±2.36-1.450.1552362.970.380.53? ≥4003310.64±2.2242968.22

*為連續性校正檢驗結果

2.1.3 CD31-MVD對LSCC的術后預后評估 27例術后5年復發患者組的CD31-MVD(/0.5 mm2)為10.19±2.11，高于34例術后5年未復發患者組(8.71±1.43，t=3.26，P<0.05)。

2.2 EZH2的表達

2.2.1 EZH2在LSCC和NLT中的表達對比 EZH2蛋白定位于細胞核，陽性染色深淺不一，表現為棕黃色或棕褐色顆粒狀，可呈灶狀或彌漫分布。LSCC中的染色深，以強陽性為主，NLT中陽性著色淺，以弱陽性為主(圖2)。EZH2蛋白表達的陽性率在LSCC為65.57%(40/61)，大于NLT 30.0%(6/20)，差異有統計學意義(χ2=23.92，P<0.05)。

A EZH2在LSCC中呈中度陽性表達；B EZH2在LSCC中呈強陽性表達；C EZH2在NLT中呈陰性表達；D EZH2在NLT中呈弱陽性表達圖2 EZH2在LSCC和NLT中的表達(SP×400)

2.2.2 EZH2與LSCC臨床病理參數的關系 EZH2陽性表達與組織學分級、T分級、臨床分期及淋巴結轉移有關(P<0.05，表1)。

2.2.3 EZH2對LSCC的術后預后評估 27例術后5年復發患者組的EZH2陽性率為74.07%(20/27)，高于34例術后5年未復發患者組的EZH2的陽性率(52.94%，18/34，χ2=3.89，P<0.05)。

2.3 CD31-MVD與EZH2的相關性分析

LSCC中EZH2表達陽性者的MVD值(/0.5 mm2)為10.62±2.03、陰性者為7.37±2.55，兩者比較差異有統計學意義(t=6.53，P<0.05)。CD31-MVD和EZH2呈正相關(r=0.67，P<0.05，圖3)。

圖3 EZH2與CD31-MVD相關性分析

2.4 CD31-MVD、EZH2與生存的關系

2.4.1 生存情況 61例LSCC失訪3例，隨訪率95.08%。3年生存率83.71%，5年生存率70.49%。

2.4.2 生存分析顯示，CD31-MVD逐漸增大，則LSCC總生存率隨之下降。在CD31-MVD各組之間差異有統計學意義(F=5.03，P<0.05)。61例LSCC患者中，18例≤5年生存組中CD31-MVD值(/0.5 mm2)為10.91±2.13，43例>5年生存組為8.76±2.52，表達差異有統計學意義(t=4.36，P<0.05)。

2.4.3 生存分析顯示，EZH2染色級別增高，則LSCC總生存率隨之下降，在EZH2表達(-)-(+++)之間差異有統計學意義(χ2=4.69，P<0.05)。61例LSCC患者中，18例≤5年生存組中與43例>5年生存組相比較，EZH2表達差異有統計學意義(χ2=4.60，P<0.05)。

2.5 LSCC預后的單因素分析

組織學分級、有無淋巴結轉移、臨床分期、吸煙指數、有無復發對預后的影響有統計學意義(P均<0.05，表2)。

2.6 多因素Cox比例風險分析

以隨訪5年生存狀態為結局變量，1=死亡，0=截尾(生存或失訪)，以表2中有統計意義的因素加上CD31-MVD、EZH2建立回歸模型。在Cox Regression中，CD31-MVD、EZH2、淋巴結轉移、臨床分期、有無復發是預后獨立影響因素(見表3)。

2.7 生存模型和預后指數

根據表3結果，建立LSCC患者的生存模型如下：h(t，x)=h0(t)exp(1.302 X1+1.531 X2+1.509 X3+2.891 X4+2.678 X5)，預后指數PI=1.302 X1+1.531 X2+1.509 X3+2.891 X4+2.678 X5(X1：EZH2；X2：CD31-MVD；X3：是否復發；X4：臨床分期；X5：有無淋巴結轉移)。說明：PI值大，則生存的可能性低、預后差；PI值小則相反。

表2 LSCC患者預后影響因素的單因素分析結果 [例(%)]

表3 LSCC患者的Cox比例風險模型多因素分析結果

3 討 論

喉鱗狀細胞癌作為一種常見的頭頸部腫瘤，其病因一直不明確，目前大多數學者認為，惡性腫瘤血管生成促進其增殖、浸潤、轉移和復發。MVD是反映血管生成的重要指標，對衡量腫瘤血管生成及預后具有重要意義[8]。CD31是免疫球蛋白超家族成員，作為血管內皮細胞標記物，CD31在成熟與未成熟的腫瘤血管中均有表達，并調節腫瘤血管生成。目前臨床上廣泛應用CD31對血管內皮細胞進行標記，可精確地反映MVD[9]。我們的研究表明：①CD31-MVD值在LSCC組織中的表達(10.26±2.46)明顯高于NLT(1.20±1.10)。CD31在LSCC中表達明顯，主要集中于腫瘤組織邊緣區的血管內皮細胞，而在NLT中表達較弱，說明CD31可提示惡性腫瘤中新生微血管的旺盛程度；②CD31-MVD值與LSCC的T分級、臨床分期、淋巴結轉移、是否復發有關；③生存分析顯示CD31可用于預后的判斷，CD31-MVD值越大，則生存期越短。

血管生成基因對于研究腫瘤血管生成機制、探尋生物治療靶點意義非常。EZH2是近年來新發現的一種血管生成基因，是多梳基因家族(polycomb group genes， PcGs)的核心成員。腫瘤血管生成機制主要在于血管生成促進因子(如血管內皮生成因子、纖維母細胞生長因子)和血管生成抑制因子(如血管抑素、內皮抑素)之間的相互調節，血管內皮細胞為調節因子作用的靶細胞，血管生成促進因子濃度升高或抑制因子濃度下降都可促進腫瘤血管生成，造成腫瘤侵襲及轉移[10]。而 EZH2主要通過 VEGF-E2、F-EZH2-VASH1[11]和 FGF-2-NDY1/EZH2-miR-101-EZH2[12]機制參與了這一調節過程。

許多研究證實，相對于正常組織，EZH2高表達于多種癌組織，如前列腺癌[13]、乳腺癌[14]、膀胱移行細胞癌[15]、胃癌[16]、肺癌[17]、口腔癌[18]、白血病[19]等，且在它們的病程發生發展、預后中起重要作用。然而，EZH2在LSCC發生發展過程中的生物學作用研究在國內外還極為少見。本研究中LSCC組EZH2呈高表達，與組織學分級、T分級、臨床分期及淋巴結轉移相關。相關性分析顯示LSCC中EZH2陽性組CD31-MVD值明顯高于陰性組、CD31-MVD計數與EZH2呈正相關，表明EZH2與LSCC血管生成有關。生存分析顯示LSCC中EZH2蛋白高表達預示著患者生存期短、預后較差。

全組61例LSCC總3年生存率83.71%，5年生存率70.49%。生存分析顯示，CD31-MVD值增加，LSCC總生存率則隨之下降，CD31-MVD計數各組之間差異有統計學意義，表明CD31-MVD高，預示患者生存期短。61例LSCC患者>5年、≤5年兩組之間EZH2蛋白表達差異均有統計學意義，EZH2蛋白表達高，則患者生存期短。在Cox多因素分析中，CD31-MVD、EZH2、淋巴結轉移、臨床分期、有無復發是預后獨立影響因素，EZH2、CD31表達高，提示LSCC預后差。

綜上所述，EZH2蛋白在LSCC中表達上調，促進LSCC新生血管生成、發展、浸潤、轉移及不良預后。這與EZH2可促進血管生成的機制及癌組織侵襲轉移相一致[20]。進一步研究、開發EZH2分子抑制劑可為LSCC的治療提供新的分子靶點和理論依據，為LSCC患者帶來了新的福音。