熒光熄滅法測定制劑中的葉酸含量

劉琳

（中安聯合煤化有限責任公司，安徽淮南232001）

葉酸（FA）是人體健康生長活動必不可少的營養物質，對機體有著重要作用，適當補充葉酸能減少畸形兒的出生，預防兒童腎衰，減少癌癥風險，預防老年癡呆，提高男性生育力，有益于記憶力和心血管健康[1]。近年來，國內外學者針對不同制劑、不同食品中葉酸含量開展研究，開發了多種葉酸含量測定的方法，如高效液相色譜法、紫外分光光度法、比色法、離子對色譜法等[2-11]。

上述測定方法有各自的優缺點，而熒光分析法操作簡便，穩定性好，選擇性高，特別適合微量或痕量物質的定性、定量測定和有機物質的分析。雖然熒光分析法測定葉酸的含量已有報道，但是基于葉酸對吖啶紅-羅丹明B體系的熒光猝滅作用，建立的測定制劑中葉酸含量的方法還未見報道。因此本文研究了吖啶紅-羅丹明B體系對葉酸的測定，建立了葉酸含量測定的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4500熒光分光光度儀（日立，日本島津株式會社）；AL204分析天平（梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司）；雷磁pHS-25數顯pH計（上海分析儀器廠）。試劑均為市售分析純，標準溶液及緩沖溶液均按相關標準配制。

1.2 熒光光譜的繪制

在10 mL比色管中加入0.5 mL吖啶紅溶液后，加入少量蒸餾水稀釋，再定容至刻度，搖勻。放置5 min后，測定其熒光光譜，確定最大激發波長和最大發射波長。用相同的方法分別測定羅丹明B溶液、羅丹明B-吖啶紅溶液體系以及吖啶紅-羅丹明B溶液-葉酸的熒光光譜，確定其最大激發波長、最大發射波長。結果如圖1～圖4所示。

圖1 吖啶紅激發光譜

圖2 羅丹明B激發光譜

圖3 羅丹明B-吖啶紅體系激發光譜

圖4 發射光譜（a：吖啶紅，b：羅丹明B，c:羅丹明B-吖啶紅體系）

由圖可知，吖啶紅的最大激發波長為490 nm，熒光峰波長為528 nm；羅丹明B的最大激發波長為535 nm，吸收峰波長為578 nm，吖啶紅的熒光峰波長距離與羅丹明B的吸收峰波長較為相近，這為以吖啶紅作為能量給予體，羅丹明B為能量接受體建立的能量轉移體系提供了前提條件。且由圖3可知，吖啶紅-羅丹明B混合體系的最大激發波長λmax為490 nm，因此實驗選擇用最大激發波長為490 nm去激發吖啶紅與羅丹明B的混合體系，結果如圖4，兩種染料之間發生有效的能量轉移，且能量轉移效果較好。

在確定實驗條件后，建立了AR-RB熒光共振能量轉移法測定制劑中葉酸含量的方法。圖5和圖6分別為加葉酸后體系的激發光譜和發射光譜，表明加入葉酸后并未改變體系的最大激發波長和發射波長。如圖6所示，用最大激發波長490 nm去激發AR-RB混合體系時，隨著葉酸濃度增加，578 nm處混合體系的能量逐漸減弱，且熒光強度減弱的程度與葉酸的濃度具有一定的線性關系。

圖5 加入葉酸后體系的激發光譜

圖6 （1為吖啶紅-羅丹明B體系，2-5分別為加入不同濃度葉酸后的曲線）

2 結果與討論

2.1 能量給體和受體濃度的影響

實驗發現，在5×10-6mol·L-1吖啶紅溶液中分別加入不同濃度的羅丹明B后，用最大激發光譜λmax=490 nm去激發體系，在發射波長為528 nm處，吖啶紅的熒光強度比單獨存在時明顯下降，而578 nm處羅丹明B的熒光強度顯著增強。當吖啶紅與羅丹明B的摩爾濃度比為1∶2時，體系的能量轉移效率最大，且加入定量葉酸，體系熒光猝滅明顯，靈敏度高，線性范圍較寬，有利于含量測定。因此，綜合考慮靈敏度和線性范圍，實驗選擇0.5 mL濃度為1.0×10-5mol/L吖啶紅溶液和1.0 mL濃度為1.0×10-5mol/L羅丹明B溶液，建立能量轉移體系。

2.2 表面活性劑的影響（圖7）

本實驗研究了十二烷基硫酸鈉（SDS）、十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、十四烷基三甲基溴化銨（TTAB）對能量轉移體系的影響。實驗發現，SDS、TTAB對體系的熒光強度影響不大，但當加入一定量SDBS時，體系熒光強度明顯增強，而且當加入一定量SDS后體系穩定性變差，故本實驗選用SDBS作為體系的表面活性劑。

圖7 表面活性劑的影響

分別加入 SDS、SDBS、TTAB 濃度為 0 mol／L、0.1 mol／L、0.3 mol／L、0.5×10-2mol／L后，能量轉移體系熒光強度改變，如圖7所示。當SDBS濃度為3×10-3mol/L時，體系的熒光強度達到最大值，且△F的值穩定，并大于其他表面活性劑下的△F。因此選擇十二烷基苯磺酸鈉的濃度為3×10-3mol/L。

2.3 溶液pH的影響

固定其他實驗條件，用不同緩沖溶液來調節體系的pH值，實驗結果如圖8，最后優選在蒸餾水的中性條件下進行實驗。

圖8 pH的影響

2.4 反應溫度的影響

圖9 為實驗條件下反應溫度在10℃～40℃時對△F值的影響。根據實驗結果可知，當反應溫度過高或過低時，相對熒光強度△F會減小，在室溫下，△F值達到最大，靈敏度較高，且體系的熒光強度相對穩定。因此，實驗是在室溫下進行的。

圖9 反應溫度的影響

2.5 反應時間的影響

按照實驗方法分析了60 min內△F隨反應時間的變化趨勢，實驗結果見圖10。△F隨著反應的進行隨之增加，但反應5 min后，△F基本保持不變，且在5～60 min內保持穩定，可判斷該反應基本完全。因此，實驗反應時間為5 min。

圖10 反應時間的影響

2.6 共存物質的影響

其他實驗條件均不變，當FA濃度為1.0×10-5mol/L時，考查了多種常見金屬離子、其他水溶性物質對實驗的干擾情況，結果表明：當允許誤差為±5%時，150倍的 Ca2+、K+、Zn2+對實驗無干擾；300 倍的 Na+、Fe2+、Ba2+、SO42-、Cl-、葡萄糖、Vtamin C 對葉酸的測定無干擾，說明該方法具有較好的選擇性。

2.7 標準曲線的繪制

按照實驗方法，改變葉酸標準溶液的用量繪制標準曲線（見圖11），其線性回歸方程ΔF=965.6c+33.267（△F代表熒光強度猝滅值，c代表葉酸濃度，單位為10-5mol/L），線性相關系數R=0.998 9，葉酸濃度在5×10-6～2.5×10-5mol/L范圍內與ΔF呈線性關系。對1.0×10-5mol/L，1.5×10-5mol/L，2.0×10-5mol/L 進行精密度實驗，得到 RSD%分別為0.92%、0.64%、0.87%（n=5）；在1.0×10-5mol/L處平均回收率為97.79%。該方法的精密度和準確度較好。

圖11 標準曲線的繪制

2.8 葉酸樣品含量測定、精密度以及回收率測定

2.8.1 精密度實驗

精密量取新配葉酸樣品溶液1 mL，按照實驗方法平行測定5次，實驗結果見表1。

表1 精密度實驗

2.8.2 樣品回收率實驗

精密量取葉酸樣品溶液1.00 mL于10 mL比色管中，再向比色管中加入1.00 mL葉酸對照品溶液，定容至刻度，配制得樣品溶液。測定葉酸含量，計算回收率，根據表2可得平均回收率為99.39%。

表2 回收率實驗

2.8.3 樣品溶液的測定

精密量取樣品液1 mL于10 mL比色管中，按照實驗方法平行實驗6次，根據每次所得樣品熒光強度，計算相對熒光強度，并代入線性回歸方程中求得樣品溶液中葉酸的含量，得到如下結果：葉酸的含量相當于標示量的99.47%，RSD約為0.74%。與采用高效液相色譜法（藥典方法）測定出的含量（100.20%，RSD為0.66%，n=5）結果一致。

3 結論

AR-RB熒光共振能量轉移法測定制劑中葉酸的含量效果較好。采用十二烷基苯磺酸鈉溶液，在中性條件下，吖啶紅與羅丹明B之間能發生有效的能量轉移，隨著葉酸的加入，體系熒光強度逐漸減弱，在此基礎上可測定葉酸的含量。

按照本文方法測定制劑中葉酸的含量，可得葉酸的含量相當于標示量的99.47%，RSD約為0.74%，回收率為99.39%，與藥典方法測得的含量（100.20%，RSD為0.66%，n=5）結果一致。

使用AR-RB熒光共振能量轉移法測定制劑中葉酸含量，操作簡單，穩定性好，靈敏度高，精密度、準確度良好，結果令人滿意。