蘇丹Ⅳ與DNA在含金屬離子環境中相互作用的研究

付彩霞，榮先國，高宗華

（濱州醫學院化學教研室，山東煙臺264003）

蘇丹紅屬偶氮苯類染料，不溶于水，能溶于非極性有機溶劑和脂肪，主要用于化學工業如工業用油、蠟和肥皂業[1]。蘇丹I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ能誘導肝細胞的癌變[2-4]，我國和許多國家都禁止將其用于食品生產中。DNA是遺傳信息的載體與基因表達的物質基礎，但能否行使正常的遺傳功能尚依賴于它與其他分子的物理、化學相互作用。本文用熒光和紫外光譜法研究了蘇丹Ⅳ與DNA在含金屬離子環境中的相互作用，考查了各成分間的相互影響，為從分子水平上認識小分子與DNA的作用機理提供依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS-55熒光分光光度計（美國Perkin Elmer公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；pH-3C酸度計（上海逸龍科技有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（龍口市先科儀器公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D電子分析天平（上海精密儀器廠）。

鯡魚精DNA（北京拜爾迪生物技術有限公司）；蘇丹IV（國藥集團上海化學試劑有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（中國醫藥集團上海化學試劑有限公司）。

鯡魚精DNA加Tris-HCl緩沖溶液配制儲備液的濃度為1.6×10-3mol·L-1；蘇丹IV用無水乙醇溶解，儲備液濃度為 1.0×10-3mol·L-1；pH=7.4 Tris-HCl（含 0.1 mol·L-1NaCl） 濃度為 0.05 mol·L-1；配制濃度為 1.0×10-5mol·L-1的 FeCl3、CuSO4、MgCl2、CaCl2溶液。實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光光譜測定方法

移取 1.0 mL 蘇丹 IV 和 1.0 mL FeCl3、CuSO4、MgCl2、CaCl2于1 cm石英比色皿中，搖勻，熒光掃描，然后用微量進樣器逐次加入不同濃度的鯡魚精DNA，搖勻，室溫下靜止5 min后進行熒光掃描。狹縫為Ex=5 nm，Em=5 nm，激發波長為650 nm，熒光掃描范圍630～670 nm。

1.2.2 紫外光譜測定方法

移取2 mL蘇丹IV于1 cm石英比色皿中，以Tris-HCl緩沖溶液為參比溶液，測定其吸收光譜，用微量注射器先后加入鯡魚精DNA和FeCl3、CuSO4、MgCl2、CaCl2溶液各50 μL，記錄待測溶液在200～400 nm的紫外吸收光譜。

2 結果與討論

2.1 金屬離子和DNA對蘇丹Ⅳ熒光光譜的影響

圖l是在有無金屬離子存在下蘇丹Ⅳ對DNA的熒光光譜。從圖1中無金屬離子的光譜圖可看出[5]，蘇丹Ⅳ在650 nm處有一最大發射峰，分別加入不同濃度的DNA后，蘇丹Ⅳ的熒光峰位置不變，但是熒光強度明顯降低，說明蘇丹Ⅳ與DNA發生了相互作用。隨著金屬離子的加入，該熒光峰的位置略有藍移（649.50 nm），熒光強度也發生了不同程度的變化，表明四種金屬離子均與蘇丹Ⅳ形成了絡合物。向四種絡合物的體系（SudanⅣ-Ca2+；Sudan Ⅳ-Cu2+；Sudan Ⅳ-Mg2+；Sudan Ⅳ-Fe3+）中加入不同濃度的DNA溶液，熒光強度發生了不同程度的猝滅，且熒光強度都小于無金屬離子的熒光強度，表明金屬離子和DNA對蘇丹Ⅳ熒光具有協同猝滅作用，可以推斷在蘇丹Ⅳ、金屬離子和DNA之間形成了三元絡 合物。

圖1 蘇丹IV與DNA在有無金屬離子存在下的熒光光譜

2.2 金屬離子和DNA對蘇丹Ⅳ紫外吸收光譜的影響

圖2 為在金屬離子和DNA存在下蘇丹Ⅳ的紫外吸收光譜。從圖2可以看出，蘇丹Ⅳ在213.50 nm處有一紫外吸收峰，隨著金屬離子的加入，該吸收峰的強度得到增強，表明四種金屬離子均與蘇丹Ⅳ形成了絡合物。向四種絡合物的體系中加入定量的DNA溶液，發現絡合物體系的最大吸收峰吸光度得到了減弱，但減弱的程度很小，最大吸收波長沒有發生變化，說明配合物與DNA發生了靜電作用或溝槽作用[6]。

圖2 金屬離子和DNA存在下蘇丹Ⅳ的紫外吸收光譜

2.3 金屬離子存在下蘇丹Ⅳ與DNA熒光猝滅機制

熒光猝滅根據作用機制不同可分為靜態猝滅和動態猝滅兩種，由熒光猝滅Stem-Volmer方程[7-8]：

公式（1）中F0和F為在猝滅劑不存在和存在時的蘇丹IV熒光強度，CDNA為猝滅劑濃度，KSV為猝滅常數，τ0為不存在猝滅劑熒光分子的平均熒光壽命（τ0≈10-8s），Kq為雙分子猝滅過程的速率常數。以F0/F對CDNA作圖，由曲線斜率算得KSV。由KSV=Kqτ0求得Kq，見表1所示，可見在有無金屬離子的條件下，Kq遠大于小分子與生物大分子之間的最大擴散控制的碰撞常數2.0×1010L·mol-1·S-1，由此可知，該體系的猝滅機制是靜態猝滅。

2.4 金屬離子存在下蘇丹Ⅳ與DNA相互作用的結合常數和結合位點數

根據靜態猝滅公式：

公式（2）中KA為DNA與蘇丹IV分子的結合常數，n為結合位點數。以lg[（F0-F）/F]對lgCDNA作圖，通過斜率和截距求出DNA與蘇丹IV的結合常數和結合位點數，見表2。

從表2可以看出，加入金屬離子后，DNA對蘇丹IV的結合常數KA和結合位點數n都發生了很大變化，說明金屬離子對蘇丹IV與DNA之間的作用產生了影響。DNA對蘇丹IV的結合常數KA和結合位點數n從大到小依次為Fe3+>Ca2+>Cu2+>無金屬離子>Mg2+，由此可得出Fe3+、Ca2+和Cu2+對DNA與蘇丹IV之間的結合起促進作用，其中Fe3+、Ca2+的促進作用最大，而Mg2+則對DNA與蘇丹IV之間的結合起抑制作用。

表1 有無金屬離子存在下蘇丹IV與DNA熒光猝滅常數和相關系數

表2 有無金屬離子存在下DNA對蘇丹IV相互作用的相關參數

3 結論

利用熒光光譜法和紫外光譜法研究了蘇丹IV-DNA和蘇丹IV-金屬離子-DNA之間的相互作用機制。DNA能猝滅蘇丹IV和蘇丹IV-金屬離子的熒光，其猝滅機制均為靜態猝滅。金屬離子介入實驗表明，Fe3+、Ca2+和Cu2+對DNA與蘇丹IV之間的結合起促進作用，而Mg2+則對DNA與蘇丹IV之間的結合起抑制作用。