高效液相色譜和超高效液相色譜法測定乳制品中三聚氰胺含量的對比

1 引言

三聚氰胺(英文名Melamine)，簡稱三胺，又名蜜胺、氰尿酰胺。分子式C3N3H6,分子量126.12。白色結晶粉末，無味，相對密度1570kg/m3。微溶于水（3.1g/L常溫），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚類、對身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。[1,2]

但由于目前食品檢測中測定蛋白質的凱氏定氮法是通過測定樣品中氮原子含量來間接推算出蛋白質含量的，而此方法無法識別氮的來源，蛋白質的平均含氮量為16%，而是三聚氰胺含氮量高達66.67%，少量添加即可大大提高產品的含氮量，不法商人借此提升食品檢測蛋白質含量指標，從而通過檢驗機構的檢測[3]。

而對于三聚氰胺的測定方法有很多，例如液相色譜法、氣相色譜-質譜法、毛細管電泳法、分光光度法、酶聯免疫法（ELISA）等，其中毛細管電泳法和分光光度法靈敏度低，只可滿足一般檢測要求；氣相色譜-質譜法需要衍生化步驟，操作繁瑣；ELISA則只適用于大批樣快速篩選檢測，若為陽性需進一步確證[4]。而液相色譜法為國標中乳與乳制品檢測的推薦方法，可定性定量[5]，但普通液相色譜法仍有測定樣品周期長，產生廢液量大的缺點，故本文對原有HPLC方法進行轉化并優化，建立超高效液相色譜（UPLC）法，為乳制品中三聚氰胺含量的測定提供更快速、高效、靈敏和環保的方法。

2 材料

2.1 儀器

島津LC_20AB型高效液相色譜儀（日本 島津）；Waters Acquity UPLC 超高效液相色譜儀(美國 沃特世)；AG285 型天平(瑞士 梅特勒)；超純水儀(美國 密理博）。

2.2 試劑

三聚氰胺對照品（CAS 108-78-01,純度大于99.0%）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、辛烷磺酸鈉（色譜純）、超純水。

3 方法與結果

3.1 色譜條件

3.1.1 HPLC色譜條件：色譜柱為 Agilent Zorbax SB_C18柱（250mm×4.6mm,5μm）;以離子對試劑緩沖溶液（2.10g檸檬酸+2.16g辛烷磺酸鈉定容1L,pH為3.0）與乙腈為流動相，V:V=95:5；流速1.0mL/min；柱溫40℃；波長240nm；進樣量10μL

3.1.2 UPLC色譜條件：色譜柱為 Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm×100mm,1.7μm）;以離子對試劑緩沖溶液（2.10g檸檬酸+2.16g辛烷磺酸鈉定容1L,pH為3.0）與乙腈為流動相，V:V=95:5；流速0.5mL/min；柱溫40℃；波長240nm；進樣量0.5μL。

3.2 對照品溶液的制備

準確稱取100mg三聚氰胺標準品于100mL容量瓶，用甲醇水溶液（1:1）溶解并定容至刻度，配制成濃度為1mg/mL的標準儲備液，于4℃避光保存。用流動相將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到濃度為0.2、2.0、10.0、20.0、30.0μg/mL的標準工作液，過微孔濾膜后備用。在HPLC條件下三聚氰胺的保留時間為15.12min,在UPLC條件下保留時間為1.12min，見下圖。

3.3 供試品溶液的制備

準確稱取2g試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入15mL1%三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超聲并振蕩后，以4000r/min離心10min，上清液過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL濾液，加入5mL水混勻后轉移至固相萃取柱中。依次以3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近干，用6mL氨化甲醇（5%）溶液洗脫。洗脫液于50℃下用氮氣吹干，殘留物用1mL流動相定容，渦旋混合1min，過微孔濾膜備用。

圖1 A HPLC三聚氰胺標準品 B UPLC三聚氰胺標準品）

3.4 方法學考察

3.4.1 線性關系考察

HPLC方法：按“3.1.1”項下色譜條件，濃度由低到高依次進樣10.0μL，以峰面積（Y）-濃度（X）作圖，得到標準曲線回歸方程y=1.69×105+3.07×105 ,r2=0.9989,三聚氰胺在0.2～30μg/mL內呈良好線性關系。

UPLC方法：按“3.1.2”項下色譜條件，濃度由低到高依次進樣0.5μL，以峰面積（Y）-濃度（X）作圖，得到標準曲線回歸方程：y=1.84×103+1.35×103,r2= 0.9999,三聚氰胺在0.2～30μg/mL內呈良好線性關系。

3.4.2 精密度試驗

HPLC方法：取“3.2”項下對照品溶液，以10.0μL進樣量，連續進樣6次，得三聚氰胺保留時間的RSD為15.21min，峰面積的RSD為0.20%，結果表明儀器精密度良好。

UPLC方法：取“3.2”項下對照品溶液，以0.5μL進樣量，連續進樣6次，得三聚氰胺保留時間的RSD為1.12min，峰面積的RSD為0.16%，結果表明儀器精密度良好。

3.4.3 重復性試驗

取濃度為20.0μg/mL的標液，照“3.3”項下的方法制備供試品溶測定三聚氰胺的含量，HPLC和UPLC的RSD分別 0.58%、0.44%。結果表明重復性良好。

3.4.4 穩定性試驗

HPLC方法：取“3.3”項下供試品溶液，以10.0μL進樣量，分別于0,2,4,8,10，12,24h注入HPLC，得三聚氰胺峰面積的RSD為0.66%，結果表明樣品中三聚氰胺在24h內穩定。

UPLC方法：取“3.3”項下供試品溶液，以0.5μL進樣量，分別于0,2,4,8,10，12,24h注入UPLC，得三聚氰胺峰面積的RSD為0.54%，結果表明樣品中三聚氰胺在24h內穩定。

3.4.5 加標回收試驗

取已知濃度的標準系列溶液做加標回收試驗，取六個平行樣，分別加入定量三聚氰胺對照品，按“3.2”項下方法制備供試品溶液，測定回收率，結果見表1。

3.4.6 樣品含量的測定

取不同品牌不同批次的乳制品20批，分別按“3.3”項下方法進行處理，并分別按照HPLC和UPLC色譜檢測條件，測定其中三聚氰胺的含量，用外標法計算。結果表明HPLC和UPLC均未檢出三聚氰胺，見圖2。

圖2 C HPLC三聚氰胺樣品 D UPLC三聚氰胺樣品

4 討論

本實驗通過對比HPLC和UPLC法對乳制品中三聚氰胺含量的測定結果表明，兩種方法的精密度、準確性等方面的差異不大，但在靈敏度方面UPLC明顯高于HPLC,并且UPLC還具有分析時間短，流動相消耗量低的優點，而在對乳制品的實際檢驗中，UPLC更能顯現出環保、高效的優點，可以在對市面流通乳制品質量的控制中得到廣泛應用。

?