2-甲氧基雌二醇對多種腫瘤細胞的體外抑制作用研究

李銀英

(鄭州大學第二附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450052)

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)是雌激素的內源性代謝產物,但對雌激素受體的親和力較低,而且對多種腫瘤細胞具有抑制作用。由于該藥只作用于增殖活躍的細胞,而對靜止細胞無作用，所以不良反應較輕。近年來，通過大量的體內外研究[1-4]發現，2-ME具有抗多種惡性腫瘤的作用，其中包括肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、骨髓瘤以及白血病等。大量研究[3-4]證明2-ME的作用機制主要為誘導細胞凋亡、抑制細胞的增生、抗新血管的生成、抑制微管的功能等，具有成為抗腫瘤藥物的潛力，本實驗旨在研究其對多種腫瘤細胞的增殖抑制率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料細胞系人食管癌細胞EC-9706、人胃癌細胞SGC-7901、人肝癌細胞SMMC-7721、人肝癌細胞HepG-2、人神經母細胞瘤細胞SK-N-SH、人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y、人前列腺癌細胞PC-3、人宮頸癌細胞HeLa、人乳腺癌細胞MCF-7，均為貼壁生長的細胞，均購自中國醫學科學院上海細胞生物研究所，并在鄭州大學藥學院長期傳代培養。

試劑與儀器：E191型CO2培養箱，美國SIM公司；倒置顯微鏡，德國Leica公司；U410型超低溫冰箱(-80 ℃)，美國NBS公司；96孔細胞培養板，美國Coming Costar公司；Spectra MR型全波長酶標儀，美國DYNEX公司；2-ME，鄭州大學藥學院化學試驗室合成；DMEM培養基，鄭州科諾生物技術有限公司；RPMI-1640培養基，鄭州科諾生物技術有限公司；優級胎牛血清，上海依科賽生物制品有限公司；磺酰羅丹明B(SRB)，美國Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)，北京Solarbio公司；胰蛋白酶，美國Sigma公司；三氯乙酸(TCA)，鄭州科諾生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 從液氮或-80 ℃冰箱中取出凍存的腫瘤細胞，迅速置于接近37 ℃的溫水中，邊搖邊振蕩，使其在數秒內完全解凍，然后將其轉移到離心管內離心(1000 r·min-1，5 min)，棄去上清液，加入適量培養基，吹打成單細胞懸液，轉移到細胞培養瓶中，置37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中培養。當細胞生長到占培養瓶體積80%～90%時，用質量分數0.25%胰酶(不含乙二胺四乙酸)對細胞進行傳代，選對數生長期的細胞進行試驗。

1.2.2 SRB法檢測2-ME對多種腫瘤細胞的體外抑制作用

1.2.2.1 2-ME對EC-9706、SK-N-SH、SH-SY5Y細胞的體外抑制作用檢測[5]取處于對數生長期的EC-9706細胞，質量分數0.25%胰酶消化收集，調整細胞濃度，5×103個/孔接種于96孔板，培養24 h后棄去培養基，實驗組加入不同濃度的2-ME(0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol·L-1)，每孔反應體系0.2 mL，空白對照組以RPMI-1640培養基補足，溶劑對照組DMSO濃度為20 μmol·L-1，每組設6個復孔，繼續分別培養24、48、72 h后，倒置顯微鏡下形態學觀察并照相，用預冷的TCA固定10 min，移入4 ℃條件下靜置1 h后，倒掉固定液，每孔用去離子水洗5次，自然晾干，于干燥的每小孔中加入100 μLSRB染色，室溫避光放置15 min，棄去染液，用質量分數1%冰醋酸將未結合的SRB染液洗去，每孔5遍，自然晾干。結合的SRB用Tris堿液150 μL溶解，搖床上放置15～20 min后，用全自動酶標儀在515 nm處測定每孔光密度(OD)值，用下列公式計算細胞增殖抑制率[6]：細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2.2 2-ME對SGC-7901、SMMC-7721、HepG-2細胞的體外抑制作用檢測 取處于對數生長期的SGC-7901、SMMC-7721、HepG-2細胞按照1.2.2.1的方法進行處理，然后將細胞以5×103個/孔接種于96孔板，培養24 h后棄去培養基，實驗組加入不同濃度的2-ME，終濃度為0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol·L-1，每孔反應體系0.2 mL，空白對照組以RPMI-1640培養基補足，溶劑對照組DMSO濃度為16 μmol·L-1，每組設6個復孔，繼續分別培養24、48、72 h后，按照1.2.2.1方法繼續處理細胞。

1.2.2.3 2-ME對PC-3、HeLa、MCF-7細胞的體外抑制作用檢測 用含體積分數10%胎牛血清、青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養基將PC-3、HeLa、MCF-7細胞培養至對數生長期，然后質量分數0.25%胰酶消化收集，因為此3種細胞生長速度較慢，所以96孔板每孔接種濃度為6×103個/孔，后續操作按照1.2.2.1的方法。

2 結果

2.1 2-ME對EC-9706細胞的體外抑制作用2-ME對EC-9706細胞的體外抑制作用隨藥物濃度和作用時間變化而變化，在作用24 h時抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時抑制作用明顯，且呈現很好的時間和濃度依賴性。2-ME作用時間為48 h和72 h的半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)分別為7.210、8.598 μmol·L-1。見表1、圖1。

表1 2-ME對EC-9706細胞的體外抑制作用

圖1 2-ME對細胞EC-9706的抑制作用

2.2 2-ME對SGC-7901細胞的體外抑制作用2-ME在作用時間為24 h時對SGC-7901細胞無明顯抑制作用，最大抑制率出現在10 μmol·L-1，數值為22.5%；當2-ME作用時間為48、72 h時，對SGC-7901細胞的抑制非常明顯，并呈現很好的時間濃度依賴性。2-ME作用時間為48 h和72 h的IC50分別為2.762、0.231 μmol·L-1。見表2、圖2。

表2 2-ME對SGC-7901細胞的體外抑制作用

圖2 2-ME對SGC-7901細胞的體外抑制作用

2.3 2-ME對SMMC-7721、HepG-2細胞的體外抑制作用2-ME對SMMC-7721細胞作用時間為24、48、72 h時，最高抑制率均出現在最大濃度點20 μmol·L-1，抑制率分別為29.0%、55.0%、72.5%，整體上在作用24 h時抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時抑制作用明顯，且呈現很好的時間和濃度依賴性。2-ME對SMMC-7721細胞48 h和72 h的IC50分別為7.871、1.453 μmol·L-1(表3、圖3)。2-ME對HepG-2細胞在藥物作用時間為24、48、72 h時，最高抑制率均出現在最大濃度點20 μmol·L-1，抑制率分別為36.6%、52.9%、79.4%，整體上在作用24 h時抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時抑制作用明顯，也呈現很好的時間和濃度依賴性。2-ME作用HepG-2細胞48 h和72 h的IC50分別為6.785、0.781 μmol·L-1(表4、圖4)。

表3 2-ME對SMMC-7721細胞的體外抑制作用

表4 2-ME對HepG-2細胞的體外抑制作用

圖3 2-ME對SMMC-7721細胞的體外抑制作用

圖4 2-ME對HepG-2細胞的體外抑制作用

2.4 2-ME對SK-N-SH、SH-SY5Y細胞的體外抑制作用2-ME對SK-N-SH細胞作用時間24 h時，最大抑制率是出現在最高濃度點的，抑制率為28.0%；而在2-ME作用時間為48 h和72 h時，最好抑制效果則分別出現在濃度為1.25、2.5 μmol·L-1時，抑制率分別為72.2%、73.4%；在出現最大抑制效果后，抑制率則變化平穩，在5、10、20 μmol·L-1這3個濃度點抑制率相近，48h時3個濃度點抑制率分別為55.6%、54.7%、55.3%，72 h時則分別為53.7%、54.3%、57.2%。整體上在作用24 h時抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時抑制作用明顯。2-ME作用時間48h和72h時的IC50值分別為1.961、1.263 μmol·L-1(表5、圖5)。2-ME對SH-SY5Y細胞的抑制，在作用時間為24、48、72h時最大抑制率均出現在最高濃度，分別為30.9%、57.5%、65.6%。整體上在作用24 h時抑制作用不明顯，作用48h和72h時抑制作用明顯，其作用基本遵循時間和濃度依賴性。2-ME作用SH-SY5Y細胞48 h和72 h的IC50分別為5.837、2.354 μmol·L-1(表6、圖6)。

表5 2-ME對SK-N-SH細胞的體外抑制作用

表6 2-ME對SK-SY5Y細胞的體外抑制作用

圖5 2-ME對SK-N-SH細胞的體外抑制作用

圖6 2-ME對SK-SY5Y細胞的體外抑制作用

2.5 2-ME對PC-3、HeLa、MCF-7細胞的體外抑制作用2-ME在濃度為2.5 μmol·L-1之前，對PC-3細胞抑制率隨濃度的變化而變化幅度較大，但是在2.5 μmol·L-1之后，抑制率隨濃度變化較為平穩，24、48、72 h這3個時間點抑制率隨濃度的變化趨勢較為一致，在作用24 h時抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時抑制作用明顯。2-ME作用48、72 h時對PC-3細胞的IC50分別為5.223、3.96 1μmol·L-1(表7、圖7)。2-ME對HeLa細胞在作用24 h時抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時抑制作用明顯，且呈時間和濃度依賴性，2-ME作用HeLa細胞48 h和72 h的IC50分別為3.276、1.897 μmol·L-1(表8、圖8)。2-ME對MCF-7細胞在作用24 h時抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時抑制作用明顯，且呈時間和濃度依賴性。2-ME作用MCF-7細胞48 h和72 h的IC50分別為2.963、2.891 μmol·L-1(表9、圖9)。

表7 2-ME對PC-3細胞的體外抑制作用

表8 2-ME對HeLa細胞的體外抑制作用

表9 2-ME對MCF-7細胞的體外抑制作用

圖7 2-ME對PC-3細胞的抑制作用

圖8 2-ME對HeLa細胞的抑制作用

圖9 2-ME對MCF-7細胞的抑制作用

3 討論

2-ME已經被證實在體外對肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、骨髓瘤以及白血病等多種腫瘤細胞具有抑制作用，且只作用于增殖活躍的細胞，而對靜止細胞無明顯作用，2-ME的作用機制主要為誘導細胞凋亡、抑制細胞的增生、抗新血管的生成、抑制微管的功能等[5-10]。幾種2-ME的藥物的臨床前和臨床試驗均顯示出了較好的耐受性，但是其較低的生物利用度限制了其在臨床中的應用，因此，下一步的研究主要集中在如何提高其生物利用度方面[7-14]。本研究證實，2-ME在體外對食管癌、胃癌、肝癌、神經母細胞瘤、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞均有良好的抑制作用，且呈不同程度的時間和濃度依賴性，但是并不是在所有濃度區間都呈濃度依賴性的。2-ME對EC-9706細胞的體外抑制隨隨藥物濃度和作用時間變化而變化，48 h和72 h時明顯高于24 h，但48 h和72 h時卻無顯著差別，甚至48h時的IC50略低于72 h；2-ME 對SMMC-7721細胞作用時間為24、48、72 h時，最高抑制率均出現在最大濃度點20 μmol·L-1，而且每組都呈現很好的濃度依賴性；2-ME對SK-N-SH細胞的體外抑制效果雖然很好，但是并不遵循很好的時間和濃度依賴性，而是在不同作用時間的不同濃度點出現最大抑制效果，在作用24 h時最大抑制率出現在最高濃度點，抑制率為28.0%，而在2-ME作用時間為48、72 h時最好抑制效果則分別出現在濃度為1.25、2.5 μmol·L-1時，抑制率分別為72.2%、73.4%；在出現最大抑制效果后，抑制率則變化平穩，在5、10、20 μmol·L-1這3個濃度點，抑制率并無較大差別。2-ME對HeLa細胞的體外抑制作用是非常明顯的，表現出很好的時間和濃度依賴性，但是在作用時間48、72 h時，10 μmol·L-1濃度點的抑制率均大于20 μmol·L-1，不同于10 μmol·L-1之前抑制率隨濃度的變化；2-ME作用于MCF-7細胞時，48、72 h時實驗數值差別不大，甚至48 h時在濃度點0.625 μmol·L-1之后，其抑制率都略高于72 h，這一結果表明，48 h之后，2-ME對MCF-7細胞的抑制率隨時間變化不太明顯，而對SGC-7901細胞的抑制對時間和劑量的依賴顯著。總之，2-ME能夠在體外抑制上述腫瘤細胞的增殖，且作用呈一定的時間和濃度依賴性，但是其具體作用機制尚需進一步深入研究闡明。