核桃莖段器官離體再生培養

陳曉明，韋璐陽，蔡 玲，梁文匯，賀佳君，陳代喜

（1.廣西壯族自治區林業科學研究院 國家林業和草原局中南速生材繁育實驗室 廣西優良用材林資源培育重點實驗室，南寧 530002；2.廣西亞熱帶作物研究所，南寧530001；3.廣西鳳山縣水果生產管理局，鳳山 547600）

中國是核桃（Juglans regia）栽培起源地之一，在我國已有2000多年的人工栽培歷史。雖然核桃起源于北溫帶地區，但對氣候適應性強，在我國亞熱帶和熱帶地區的27個省、市、自治區均有廣泛分布和大面積栽培，是我國重要的闊葉經濟木本樹種之一[1-2]。核桃營養豐富，富含人體所需的18種氨基酸、有益脂肪酸、多種礦質營養、維生素和豐富的卵磷脂[3]。當前，全國各地大力發展核桃產業，然而大規模栽培核桃，培養大量具有優良性狀的種苗是前提。在長期栽培和人為選擇過程中，我們獲得了很多核桃優良品種和類型，但是不完善的繁殖技術阻礙了核桃優良品種的推廣。傳統的核桃苗木繁殖，一般采用嫁接的方法，存在繁殖系數低、速度慢、成活率不穩定、受穗條數量限制等不利因素[4]。應用組織培養技術，核桃組培苗遺傳穩定性好，生產周期大大縮短，為核桃的良種苗木規模化生產提供巨大的潛力。近年來，雖然有用核桃莖段進行離體快繁技術的研究，但不同的核桃品種需要的營養和植物激素的濃度均有較大差異[5-10]。本研究通過對核桃組培系列技術中的營養元素與植物生長激素的調節，建立本地核桃優良品種“鳳優1號”高效、可靠的核桃莖段離體快繁體系，為大規模良種繁殖奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年9月在廣西河池鳳山縣金牙鄉坡茶村“鳳優1號”10～15年生的核桃林中進行優株選擇，選擇年均產干果5 kg以上的健康成年樹為優良單株，11月對優良單株進行肥水管理，每株施氮磷鉀含量各為15%的復合肥1 kg，促進樹體生長。枝條在翌年的2月份開始萌動生長。分別在3月、4月和5月采集優株樹冠中上部外圍健壯的當年生枝條，枝條采集后放保溫箱冷凍保鮮、保濕，帶回實驗室備用。

1.2 外植體滅菌

用50%多菌靈可濕性粉劑1 000倍浸泡莖段2 h，初步滅菌，然后用10%（V/V）表面活性劑吐溫-80浸泡30 min，用無菌蒸餾水洗滌，再用0.1%（W/V）氯化汞溶液處理8～13 min，最后用無菌蒸餾水洗滌5次，用無菌濾紙吸干水分后，接種到DKW+0.5 g/L硫代硫酸鈉培養基中。每個處理接種60個外植體，培養15 d后觀察無菌活體得率。

1.3 初代培養

以DKW為基本培養基，細胞分裂素6-BA的濃度分別為0.5、1和2 mg/L，各處理均添加0.05 mg/L IBA、3%蔗糖和4.5 g/L瓊脂，選取滅菌14 d后無菌活體接種到以上各處理中，每處理接種10瓶，每瓶1個莖段，3次重復。于1 500 lx光照下培養，肉眼觀察到分化生長的芽時定為外植體始芽萌動，30 d進行誘導率的統計。

1.4 增殖培養

選擇6-BA、IBA和基本培養基為試驗因素，試驗用L9（34）正交表試驗設計，6-BA的試驗水平為0.2、0.5、1.0 mg/L；IBA的試驗水平為0.05、0.1、0.2 mg/L；基本培養基的3個試驗水平為MS、DKW、SH。共設計9個處理，每處理接種無菌芽5顆，3次重復，于2 000 lx光照下培養，30 d統計各處理的增殖率，以有一片展開小葉的小芽為統計對象。芽增殖系數＝增殖后芽總數/接種芽數。

1.5 離體生根

以1/2 SH+2%蔗糖+5.0 g/L瓊脂+0～10mg/L IBA為生根培養基，每處理接種10瓶，每瓶3個單芽，共進行3次重復。先在室內自然光照條件下培養7 d，然后在室內2 000 lx的光照條件下培養28 d。

1.6 培養條件

所有培養基均添加0.5 g/L硫代硫酸鈉，以減輕褐化對核桃生長的影響。除了初代培養和生根培養前7 d外，其余的均在16/8 h（光/暗）光周期、光照強度2 000 lx（LED光源）、室溫（25±2）℃的環境條件下進行培養。

1.7 統計分析

定期記錄芽再生率、芽增殖率、莖長和生根情況，數據處理和圖表制作采用Excel 2007完成，用DPS軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 采集和消毒時間對外植體滅菌效果的影響

采用0.1%HgCl2分別對3、4和5月份采集的外植體進行表面滅菌處理，3個月份的外植體均隨著處理時間的延長，污染率呈下降的趨勢（表1）。從無菌褐死數來看，延長消毒時間雖然污染率降低，但無菌褐死數增加。因此，外植體的滅菌效果需要綜合考慮污染率和無菌褐死數，污染率低、無菌褐死數也低才為最佳的消毒方案。3月和4月份采集的外植體，當0.1%HgCl2處理時間為10 min時滅菌效果最佳，無菌活體得率分別為36.0%和34.0%，顯著高于其它2個滅菌時間的處理。5月份采集的外植體滅菌時間在10 min和13 min的效果差異不顯著，無菌活體得率均為28.33%。從同一滅菌時間看，不同月份外植體的污染率和無菌褐死數均不同，隨著采集月份的增加，滅菌效果變差，但無菌褐死數降低。

2.2 細胞分裂素6-BA對外植體始芽誘導的影響

細胞分裂素6-BA對莖段初始芽的誘導有顯著的作用[7,9]。細胞分裂素6-BA對核桃腋芽誘導有較大影響，3月份采集的外植體當6-BA濃度增加到1.0 mg/L時，腋芽誘導率為40.21%（表2）。4月和5月份采集的外植體，6-BA濃度為0.5 mg/L時，誘導率分別為40.12%、50.33%；6-BA濃度增加到1.0 mg/L時，誘導率與6-BA濃度為2.0 mg/L時的差異不顯著；誘導的腋芽在含6-BA 1.0 mg/L的誘導培養基中生長健壯、葉色濃綠，沒有出現玻璃化現象，6-BA濃度為2.0 mg/L時，腋芽相對于1.0 mg/L表現出芽段粗，一半腋芽呈玻璃化狀態。3月份采集的外植體在2.0 mg/L的濃度時同樣出現玻璃化現象。由此可知，核桃莖段外植體始芽誘導需要一定濃度的6-BA誘導才能獲得理想的腋芽。本試驗條件下的6-BA濃度為1.0 mg/L時，可得到較高質量的始芽進行下一步的繼代培養。

表1 外植體表面滅菌效果Tab.1 Effects of surface sterilization of explants

表2 細胞分裂素6-BA對外植體初始不定芽誘導和生長的影響Tab.2 Effects of 6-BA on induction and growth of initial adventitious shoots in explants

2.3 基本培養基和激素配比對核桃不定芽增殖的影響

以3種不同基本培養基與不同濃度細胞分裂素6-BA和生長素IBA配合使用，研究核桃叢生芽誘導的最佳配方。通過對正交設計的直觀分析發現，不同的基本培養基和不同的植物生長調節和濃度影響核桃增殖的主次不一。根據極差的數值可知（表4），影響核桃不定芽增殖的主要因素是基本培養基，其次是細胞分裂素6-BA，生長素IBA的影響最小。通過對比T值的大小，可得到各因素的較優水平，在基本培養基中以SH為較優水平，6-BA濃度的較優水平為0.5 mg/L，IBA的較優水平是0.1 mg/L。因此，核桃增殖培養的最佳培養基為SH+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L。表中處理5正好出現了這一組合，其增殖系數為4.32，顯著高于其它處理。

表3 正交L9（34）試驗安排及結果分析表Tab.3 Orthogonal L9 （34） experimental arrangement and results analysis

2.4 IBA對核桃不定根誘導的影響

生根試驗以1/2 SH為基本培養基，研究不同濃度IBA對核桃組培苗生根的影響（表4）。沒有IBA或低水平的IBA濃度（2 mg/L）均不能誘導生根，當IBA的濃度增加為5.0 mg/L時，12 d后開始觀察到少部分芽基部露出白色根點，但生根率較低，只有23.57%，且生根的植株一般只有一條根，根較細長，無愈傷組織出現。當IBA濃度增加到8.0 mg/L時，生根率增加到63.18%，每株小苗長2～3條根，根較5.0 mg/L的粗大，開始有少量愈傷組織。IBA濃度加大到10.0 mg/L時，生根率為65.24%，與8.0 mg/L的沒有明顯差異，生根率并沒有隨著生長素濃度加大而明顯增加，而且基部長滿愈傷組織。以上分析表明，在1/2 SH培養基中添加8.0 mg/LIBA，生根效果最佳。

表4 不同濃度IBA對核桃不定根誘導的影響Tab.4 Effects of different concentrations of IBA on adventitious root induction of Juglans regia

3 結論與討論

外植體滅菌是植物組織培養的關鍵環節，無菌活體的得率直接影響到離體培養的進程，高比例無菌活體的獲得主要取決于較低污染率和褐死率。因此，合適的滅菌時間是高無菌活體獲得率的關鍵條件。本研究對3個月份采集的外植體進行滅菌處理，獲得的最佳的滅菌時間為10 min。劉昊等[6]用0.1%升汞處理“強旱”核桃莖段的最佳滅菌時間為10 min，污染率與本試驗相當。不同木質化程度的莖段材料，其萌芽率和褐化率均有差異，在廣西的氣候條件下，4—5月份的當年生嫩枝已經出現了半木質化，試驗結果表明，半木質化莖段的外植體萌芽率和褐化率均優于3月份未木質化外植體，張小紅等[11]和牛青等[12]也認為半木質化莖段其褐化率和萌發率均優于未木質化嫩莖，與本研究結論一致。本研究用同樣的滅菌方法，半木質化莖段的滅菌效果顯著低于未木質化嫩莖，這是由于半木質化莖段在野外生長時間相對較長，附著在表面的污染物相對較多造成。為了降低污染率，有學者提出將所需品種進行嫁接后，移入溫室培養相對干凈的枝條，當達到半木質化程度后取莖段進行滅菌處理[13]。應用此方法是否能有效控制外植體污染，有待下一步的驗證。同時，核桃莖段富含酚類物質，對外植體進行切割時從傷口分泌出的酚類物質氧化成醌，使培養物褐化，進而破壞培養物的正常分化和生長[14]，有研究表明0.5～1.0 g/L硫代硫酸鈉對抑制莖段外植體褐化效果最好[5,10]。因此本研究所有培養基均添加0.5 g/L硫代硫酸鈉以減輕褐化對核桃生長的影響。大多數核桃組培研究的結果表明，DKW是最適合核桃組培的基本培養基[6,9,15-16]，本研究的結果顯示，SH在鳳優1號的表現優于DKW或MS。牛青等[12]用MS為基本培養基在金薄香核桃莖段培養中效果最佳，李建軍等[17]也認為MS基本培養基適合用于美國黑核桃的組培培養。表明不同的核桃品種其營養需求有較大差異。細胞分裂素激活外植體節部的腋芽，當6-BA濃度為1.0 mg/L時，可得到較高質量的始芽進行下一步的繼代培養。這可能是適宜的6-BA濃度提高了某些轉化酶（如SOD、POD、CAT等）的活性，從而促進培養物的生長[7]。本研究還試驗了不同6-BA濃度對芽增殖的影響，在一定濃度范圍內，節間分生組織的芽增殖系數隨細胞分裂素濃度的增加而增加。很多核桃在芽增殖過程中對6-BA表現出良好的反應。劉昊等[6]用6-BA 1.0 mg/L取得較好增殖效果，苗玉青等[9]用6-BA 1.0 mg/L配合1.0 mg/L IBA，增殖倍數達到4.4倍，且苗木生長狀況良好。本研究以SH為基本培養基，0.5 mg/L 6-BA配合0.1 mg/L IBA，增殖倍數也能達到4.32倍。

核桃是一種難生根植物[18]，除了奇異核桃的生根率較高外，其他種類的核桃生根率一直較低而且不穩定[8]。苗玉青等[9]的“溫18”薄皮核桃品種的生根試驗表明，生根效果最優的是1/2 DKW添加5.0 mg/L IBA，生根率雖然可高達73.3%，但根系愈傷化嚴重且畸形，這種生根苗移栽基本不能成活。裴東等[19]認為IBA是較適合誘導核桃組培苗生根的生長素，外源IBA均可誘導核桃嫩莖的內源IAA和ABA升高，從而改變嫩莖內源激素平衡狀況，進而促進不定根的發生。本研究中誘導生根最佳的IBA濃度為8.0 mg/L，生根率為63%以上，每株小苗能長2～3條根。