復(fù)合酶提取綠茶茶多酚工藝及其抑菌性

李堆淑

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

綠茶為山茶科植物茶（Camellia sinensis）的嫩葉，其最主要的成分是綠茶多酚，綠茶多酚主要成分為兒茶素，占總酚含量的60%～80%[1]。茶多酚具有防腫瘤、預(yù)防心血管疾病、防齲齒等藥理與生理功能，還具有優(yōu)異的抗氧化和清除自由基能力[2]、抗衰老作用[3-4]、抗癌治病[5]、抗輻射[6]、降低血糖血脂和膽固醇[7-8]、抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗菌抑酶[9]等保健作用。常飲綠茶可以預(yù)防癌癥，降低脂肪和減肥，還可減輕尼古丁對(duì)吸煙者的傷害。茶多酚提取工藝有水和有機(jī)溶劑提取法、超臨界萃取法、金屬離子鹽沉淀法、樹(shù)脂吸附法、超聲波輔助提取法、微波提取法。但綠茶茶多酚提取工藝采用復(fù)合酶法提取的報(bào)道較少，尤其采用復(fù)合酶法，并結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化綠茶茶多酚提取工藝未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本文采用纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶輔助提取綠茶中茶多酚，在單因素基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化綠茶茶多酚的工藝，并研究綠茶茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和大腸桿菌（Escherichia coli）等細(xì)菌的抑菌性。

1 材料與方法

1.1 材料

綠茶：市售成品綠茶（產(chǎn)自商洛市商南縣）。

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌：商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器及試劑

儀器：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠，721型）、電熱恒溫水浴鍋（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，HHS-11-2型）、循環(huán)水真空抽濾機(jī)（上海亞榮生化儀器廠，HZ-Ⅲ型）、電子天平（上海精科天平廠，F(xiàn)A1104型）。

試劑：果膠酶（酶活≥1.1 U/mg，F(xiàn)luka），纖維素酶（酶活≥15 000 U/g，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、醋酸乙酯、無(wú)水乙醇均為化學(xué)分析純。

1.3 方法

1.3.1 茶葉茶多酚的提取

將綠茶茶葉粉碎，過(guò)80目篩，準(zhǔn)確稱取綠茶茶葉末2.000 g于100 mL燒杯中，加入復(fù)合酶（纖維素酶和果膠酶質(zhì)量比1∶1）6.0 mg和pH 4.8的NaAc-HAc緩沖液，再加入無(wú)水乙醇減壓抽濾，得到濾液，避光，放冰箱備用。

1.3.2 茶多酚得率的檢測(cè)

采用酒石酸亞鐵分光光度法[10]，準(zhǔn)確稱取50 mg（精確到0.000 1 g）茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品，溶解定容到100 mL的容量瓶中，搖勻，然后分別取0、0.5、1.5、2.0、2.5、3.0 mL放入25 mL比色管中，以空白試劑作參照，在波長(zhǎng)540 nm下，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=9.210 6x+0.001 8，R2=0.999 7，檢測(cè)茶多酚的得率。

1.3.3 抑菌性試驗(yàn)

將培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌分別接入無(wú)菌水，在37℃，130 r/min培養(yǎng)24 h后，將3種細(xì)菌懸濁液（菌數(shù)1×108cfu/mL）各取0.2 mL，分別接種于不同培養(yǎng)基，涂勻，然后將提取的綠茶茶多酚粗提液配成濃度為1×10-4、2× 10-4、5 × 10-4、1× 10-3、1× 10-2mg/mL，乙醇濃度50%為對(duì)照，將直徑為15 mm的濾紙片浸泡于不同濃度的粗提液30 s后，用無(wú)菌的鑷子接于培養(yǎng)基，每皿接3個(gè)濾紙片，重復(fù)3次。在37℃，培養(yǎng)1～2 d，觀察抑菌圈直徑大小。

抑菌率%=[（樣品抑菌圈直徑-空白抑菌圈直徑）/樣品抑菌圈直徑]×100%

1.3.4 單因素試驗(yàn)

（1）酶添加量。準(zhǔn)確稱取2.000 g茶葉末，pH 4.8，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間90 min，乙醇濃度50%，考察酶添加量為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL對(duì)茶多酚得率的影響。

（2）酶解溫度。準(zhǔn)確稱取2.000 g茶葉末，酶添加量2.5 mL，pH 4.8，酶解時(shí)間90 min，乙醇濃度50%，考察酶解溫度分別為30、40、50、60、70℃對(duì)茶多酚得率的影響。

（3）pH值。準(zhǔn)確稱取2.000 g茶葉末，酶添加量2.5 mL，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間90 min，乙醇濃度50%，考察酶解pH值分別為3.2、4.0、4.8、5.6、6.4對(duì)茶多酚得率的影響。

（4）乙醇濃度。準(zhǔn)確稱取2.000 g茶葉末，酶添加量2.5 mL，pH 4.8，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間90 min，考察乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%對(duì)茶多酚得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選取酶添加量、酶解溫度、pH值、乙醇濃度4個(gè)因素，以茶多酚得率為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素水平編碼（表1）。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶添加量對(duì)綠茶茶多酚得率的影響

當(dāng)酶添加量不斷增加時(shí)，綠茶茶多酚得率呈先增加后下降趨勢(shì)（圖1）。其原因?yàn)椴瓒喾拥燃?xì)胞內(nèi)物質(zhì)在酶的催化下快速擴(kuò)散溶解[11]，當(dāng)酶添加量增加到2.0 mL時(shí)，綠茶茶多酚得率達(dá)到最高峰（19.06%），隨后再增加酶添加量，綠茶茶多酚逐漸降低，其原因?yàn)槊柑砑恿坷^續(xù)增加而底物濃度保持不變導(dǎo)致酶不再飽和，使酶解反應(yīng)被抑制。因此，最佳酶添加量為2.0 mL。

圖1 酶添加量對(duì)綠茶茶多酚得率的影響Fig.1 Effect of enzyme addition amount on yield of green tea polyphenols

2.1.2 酶解溫度對(duì)綠茶茶多酚得率的影響

當(dāng)酶解溫度逐漸升高時(shí)，綠茶茶多酚得率也隨著提高，當(dāng)酶解溫度升到50℃時(shí)，綠茶茶多酚得率達(dá)到最高峰（17.00%），之后再增加酶解溫度，茶多酚得率逐漸下降（圖2）。其原因?yàn)槊傅鞍资軣嶙冃裕搁_(kāi)始逐漸失活，從而抑制了酶解作用[12]。因此，酶解的最佳溫度為50℃。

圖2 酶解溫度對(duì)茶多酚提取效果的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on yield of green tea polyphenols

2.1.3 pH值對(duì)綠茶茶多酚得率的影響

pH不斷升高綠茶茶多酚得率也不斷增加，當(dāng)pH升高到4.8時(shí)，綠茶茶多酚得率達(dá)到最高峰（17.26%），隨后pH值再升高，綠茶茶多酚得率逐漸降低（圖3）。酶的活性不僅受溫度影響還受pH影響，酶都有相應(yīng)的最適pH值，當(dāng)酶在反應(yīng)中達(dá)到其最適pH值時(shí)，此時(shí)的酶解反應(yīng)效率最高。pH過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶的活性發(fā)生變化，同時(shí)使細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散出來(lái)的茶多酚發(fā)生解離。因此，最佳酶解pH為4.8。

圖3 pH對(duì)茶多酚提取效果的影響Fig.3 Effect of pH on yield of green tea polyphenols

2.1.4 乙醇濃度對(duì)綠茶茶多酚得率的影響

隨著乙醇濃度的增加，綠茶茶多酚得率逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度增加到50%時(shí)，綠茶茶多酚得率達(dá)到最高峰（20.06%），之后再增加乙醇濃度，綠茶茶多酚得率逐漸降低，乙醇濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致茶葉中某些蛋白質(zhì)發(fā)生變性，降低顆粒的滲透性，因此茶多酚得率下降[13]。所以，最佳乙醇濃度為50%。

圖4 乙醇濃度對(duì)茶多酚提取效果影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on yield of green tea polyphenols

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化綠茶茶多酚提取條件

2.2.1 響應(yīng)曲面結(jié)果及模型方案的方差分析

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件，對(duì)響應(yīng)面回歸過(guò)程進(jìn)行分析,建立響應(yīng)面的回歸方程：綠茶茶多酚得率（%）=-1 548.62+472.85A-5.68B+248.31C+25.31D-0.75AB-37.06AC+0.29AD+3.29BC+0.08BD+1.43CD-66.68A2-0.13B2-42.28C2-0.36D2（表2）。

表2 綠茶茶多酚提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Response surface design and results of green tea polyphenols extraction

該模型的P＜0.000 1，呈極顯著性，模型失擬項(xiàng)差異不顯著（P＞0.05），決定系數(shù)R2=0.920＞0.900，可見(jiàn)，該模型的擬合度良好（表3）。影響綠茶茶多酚優(yōu)化條件的因素順序?yàn)槊柑砑恿浚久附鉁囟龋緋H＞乙醇濃度，說(shuō)明酶添加量對(duì)綠茶茶多酚得率的影響最為顯著。酶添加量和pH交互作用對(duì)綠茶茶多酚得率呈顯著性影響，酶解溫度和pH交互作用對(duì)綠茶茶多酚得率呈極顯著影響。

2.2.2 響應(yīng)面分析

因素的交互作用可以從響應(yīng)曲面坡度變化得到反映，響應(yīng)面坡度越陡峭，因素的交互作用對(duì)綠茶茶多酚得率的影響越顯著（圖5～10）。同樣響應(yīng)面在底面倒影的等高線圖形狀能反映各因素交互作用的強(qiáng)弱，等高線圖是橢圓形，說(shuō)明因素交互作用對(duì)綠茶茶多酚得率的影響比較顯著，橢圓形越扁，說(shuō)明因素交互作用對(duì)綠茶茶多酚得率的影響越顯著；等高線圖越接近圓形，說(shuō)明因素交互作用對(duì)綠茶茶多酚得率的影響越不顯著。可見(jiàn)，同樣得到酶添加量和pH交互作用對(duì)綠茶茶多酚得率的影響呈顯著性、酶解溫度和pH交互作用對(duì)綠茶茶多酚得率的影響呈極顯著，其他因素交互作用對(duì)綠茶茶多酚得率影響不顯著。

2.3 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證

由Design-Expert分析軟件得到的最佳提取綠茶茶多酚得率的工藝條件：酶添加量2.06 mL、酶解溫度48.72℃、pH 4.77、乙醇濃度50.02%，在該條件下綠茶茶多酚得率為24.68%。為了試驗(yàn)方便操作，修正后的提取工藝條件：酶添加量2.0 mL、酶解溫度50℃、pH值4.8、乙醇濃度50%，再進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，實(shí)測(cè)綠茶茶多酚平均得率為24.59%，與預(yù)測(cè)值相差較小，說(shuō)明此方程模型所得的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.4 綠茶茶多酚的抑菌性

對(duì)照為乙醇濃度50%，發(fā)現(xiàn)也有抑菌圈（表4），其原因?yàn)橐掖急旧砭途哂幸志饔谩５牵@并不影響抑菌試驗(yàn)的整體效果。綠茶茶多酚的濃度與抑菌效果成正相關(guān)。在綠茶茶多酚濃度為1×10-2mg/mL時(shí)，其對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌性最為敏感，抑菌率分別為46.01%和45.77%。從整體來(lái)看，綠茶茶多酚對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制效果比較顯著，而對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果較小。

表3 綠茶茶多酚提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Tab.3 ANOVA of response surface of extraction of green tea polyphenols

圖5 酶添加量和酶解溫度交互對(duì)綠茶茶多酚得率影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of effects of interation between enzyme addition amount and enzymatic hydrolysis temperature on yield of green tea polyphenols

圖6 酶添加量和pH交互對(duì)綠茶茶多酚得率影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface of effects of interaction between enzyme addition amount and pH on yield of green tea polyphenols

圖7 酶添加量和乙醇濃度交互對(duì)綠茶茶多酚得率影響的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of effects of interaction between enzyme addition amount and ethanol concentration on yield of green tea polyphenols

圖8 酶解溫度和pH交互對(duì)綠茶茶多酚得率影響的響應(yīng)面Fig.8 Response surface of effects of interaction between enzymatic hydrolysis temperature and pH on yield of green tea polyphenols

圖9 酶解溫度和乙醇濃度交互對(duì)綠茶茶多酚得率影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface of effects of interaction between enzymatic hydrolysis temperature and ethanol concentration on yield of green tea polyphenols

圖10 pH和乙醇濃度交互對(duì)綠茶茶多酚得率影響的響應(yīng)面Fig.10 Response surface of effects of interaction between pH and ethanol concentration on yield of green tea polyphenols

表4 不同濃度綠茶茶多酚的抑菌率Tab.4 Inhibition rates of green tea polyphenols with different concentrations

3 結(jié)論

本研究以提取綠茶茶多酚得率為考察目標(biāo)，在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化綠茶茶多酚的提取工藝，最終得到綠茶茶多酚提取最佳工藝參數(shù)為酶添加量2.0 mL、酶解溫度50℃、pH 4.8、乙醇濃度50%，此條件下的茶多酚得率為24.59%，接近預(yù)測(cè)值24.68%，說(shuō)明此模型可靠。并且得到影響綠茶茶多酚優(yōu)化條件的因素順序?yàn)槊柑砑恿浚久附鉁囟龋緋H＞乙醇濃度。通過(guò)綠茶茶多酚的抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，綠茶茶多酚濃度與抑菌效果成正相關(guān)，從整體來(lái)看，綠茶茶多酚對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制效果比較顯著，而對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果不顯著。