響應面法優化蒲公英總黃酮提取工藝及其抑菌活性

延 永，張亦琳，吳永玲，楊蓉蓉

（商洛學院生物醫藥與食品工程學院，陜西商洛 726000）

蒲公英（Taraxacumspp.），菊科（Compositae），多年生草本植物，味微苦，平微寒，具有清肺利嗽、消腫散結和養陰涼血等功效[1]。研究表明，蒲公英具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化、保肝利膽、保護胃腸道、調節免疫等多種功效[2]。但蒲公英口感不佳，難以添加到日常飲食中。經分析，蒲公英所含化學物質種類繁多，含有機酸、黃酮、揮發油、三萜類等[3-4]。蒲公英的藥用價值與其所含黃酮類物質有著極大的關系[5]，對蒲公英進行深加工，提取其有效活性成分，在食品、保健品領域加以應用，具有非常重要的經濟價值和現實意義[6]。目前，蒲公英提取的溶劑一般為醇類[7]、水[8]等大極性溶劑，提取手段有（加熱）回流[9]、超聲輔助[10]、微波輔助[11]等。綜合對比，乙醇回流提取蒲公英總黃酮具有操作簡便、毒性低、污染少、效率高的優點[12]。但是，目前的乙醇回流提取工藝并沒有考慮浸泡對提取效果的影響，有研究表明，中藥材經充分浸泡后再加熱煎煮提取有效成分，有助于提高提取得率[13]。

基于此，本研究在傳統回流提取工藝的基礎上，首次增加溶劑浸泡環節，通過對提取各單因素進行分析和響應面試驗優化，希望開發出方法簡便、提取率高的蒲公英總黃酮提取工藝，并對提取物的抑菌活性進行研究，為蒲公英的開發利用提供技術支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙醇為分析純，購自天津市大茂化學試劑廠；NaOH（片狀）、Al（NO3）3、NaNO2均為分析純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所）；蒲公英（四川峨眉山市售）。供試菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌由張亦琳博士提供。粉碎機（HK-02A，廣州旭朗機械設備有限公司）；紫外可見分光光度計（UV-755B，上海分析儀器總廠）；高壓滅菌鍋（YXQ-LS-18SI，上海博迅）；恒溫恒濕培養箱（DHP-9052，上海華鄰）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蒲公英總黃酮的提取方法

在250 mL的圓底燒瓶中加入蒲公英粉末（過60目篩）2.0 g，加入確定量溶劑后，浸泡，加熱回流，待體系冷卻后，過濾除去固體廢棄物，濾液為蒲公英總黃酮提取液。

1.2.2 提取液中總黃酮含量測定方法

蒲公英總黃酮含量測定采用蘆丁標準曲線法[14]，以吸光度值A為坐標軸Y，標準品濃度（C）為坐標軸X，繪制蘆丁標準曲線，模擬回歸方程：Y=10.88X-0.007 9，R2=0.998 4。測試樣品在濃度0.01～0.08 g/L范圍內呈良好的線性關系。

移取5.0 mL提取液于50 mL容量瓶，水定容后，移取1.0 mL至25 mL容量瓶，按照配置蘆丁系列溶液的方法[14]處理樣品。在吸光度510 nm處，測得吸光度，根據回歸方程計算總黃酮濃度，總黃酮得率Y（%）由下式計算所得。

式中：Y-總黃酮得率（%）

C-總黃酮濃度（mg/mL）

N-稀釋倍數

V-提取液取樣量（mL）

W-藥材投入粉末質量（mg）

1.2.3 蒲公英總黃酮提取的單因素（各因素）試驗

按1.2.1方法提取蒲公英總黃酮，以乙醇體積分數（70%）、料液比（1∶30 g/mL）、浸泡時間45 min、回流時間2.5 h為基礎水平，依次考察蒲公英總黃酮提取工藝中乙醇體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL）、浸泡時間 （15、30、45、60、75 min）、回流時間（1、1.5、2、2.5、3 h）各水平對得率的影響。考察單一因素影響時，其他因素水平與基礎水平一致，以蒲公英得率為指標，繪制各試驗因素對蒲公英總黃酮得率的影響曲線圖。

1.2.4 蒲公英總黃酮提取的響應面試驗優化

在單因素測試的基礎上，確定響應面試驗的因素水平（表1）。運用Box-Behnken響應面設計方案，優化蒲公英總黃酮提取工藝，以總黃酮得率Y（%）為相應參數，考察各因素水平對其提取的影響，并驗證最佳工藝。

表1 Box-Behnken設計實驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.2.5 MIC和MBC值的測定

參考文獻方法[15-16]測定MIC和MBC值。將蒲公英總黃酮提取物配制成濃度0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 mg/mL的系列溶液，滅菌條件下，分別量取10.0 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基、100.0 μL菌懸液（104～105CFU/mL）和1.0 mL配制的系列溶液于錐形瓶（50 mL）中。37℃、160 r/min條件下培養24 h后測量吸光度值A（λ=517 nm），當A=0時，對應的濃度為MIC值；37℃、160 r/min條件下培養48 h后測量吸光度值A（λ=517 nm），當A=0時，對應的濃度為MBC值[17]。

2 結果與分析

2.1 蒲公英總黃酮提取的單因素（各因素）試驗結果

當乙醇濃度由50%增加到60%時，蒲公英總黃酮提取率大幅提升，在60%時達到頂峰（7.32%）（圖1）。繼續增加乙醇濃度，提取率出現下滑，可能是60%左右乙醇含量溶液的極性與黃酮的極性比較匹配，有利于黃酮類化合物的溶出；液料比達到1∶40（g/mL）時，提取率達到最大值7.31%。繼續增大料液比蒲公英總黃酮提取率出現下降趨勢，蒲公英含量過低不利于酮類化合物溶出；浸泡時間對提取率影響較大，浸泡時間太短不利于蒲公英黃酮的提取。分析發現最佳的浸泡時間應該在45 min左右，提取率達到最大值6.93%；回流時間對提取的影響與浸泡時間類似，提取率有明顯增加的過程，2.5 h時，達到6.92%（峰值）。繼續增加到3 h時，提取率下降，可能的原因是長時間的高溫回流，破壞蒲公英黃酮的分子結構，以至于提取率減小。

2.2 蒲公英總黃酮提取的響應面試驗結果

圖1 各試驗因素對蒲公英總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of each experimental factor on yield of total flavonoids from Taraxacum

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件，以蒲公英總黃酮提取率為響應值（表2），進行二次響應面回歸分析，得到如下回歸方程。

總黃酮提取率=7.91+0.32A-0.068B+0.017C+0.024D-0.03AB-0.01AC-0.03AD-0.04BC-0.04BD+0.013CD-1.02A2-0.17B2-0.19C2-0.31D2

表2 蒲公英總黃酮提取率的響應面法實驗結果Tab.2 Response surface method for extraction rate of total flavonoids from Taraxacum

響應面模擬的模型高度顯著（P＜0.001），方差分析表明該模型可靠性好，失擬不顯著，實驗測量值與模型預測值基本一致，R2=0.985 5（表3）。變異系數CV=1.30，說明試驗可操作性較好。應用該模型充分擬合實驗數據，發現蒲公英總黃酮的提取率變化與所選變量相關，其中乙醇體積分數（A）是高度相關（P＜0.001），料液比（B（顯著相關（P＜0.05）。在模型模擬范圍內，各因素對蒲公英總黃酮的提取率影響程度大小的順序為乙醇體積分數（A）＞料液比（B）＞回流時間（D）＞浸泡時間（C）。

表3 蒲公英總黃酮提取率的方差分析Tab.3 Variance analysis of extraction rate of total flavonoids from Taraxacum

運用Design-expert 8.0.6.1軟件分別繪制各因素的3D響應面曲面圖（圖2）。直觀地反映各優化因素對蒲公英總黃酮提取率的影響，形象地看出最佳參數及各參數之間的相互作用[18]。乙醇體積分數對蒲公英總黃酮提取率影響最大，表現為相關曲面斜率大（圖2a、2b、2c）。響應面圖投影面為等高線圖，等高線的形狀可反映出各因素交互作用的強弱[19]，各試驗因子之間均存在較強的交互作用，其等高線呈現明顯的橢圓形狀，與上述回歸方程的方差分析結果相一致（圖2）。模型預測最佳提取工藝：乙醇體積分數61.58%、料液比1∶37.72 g/mL、浸泡時間46 min、回流時間2.52 h，總黃酮的理論得率為7.944%。

2.3 驗證性實驗

結合試驗的可行性，將預測參數調整為乙醇體積分數61.6%、料液比1∶38 g/mL、浸泡時間46 min、回流時間2.5 h，平行提取3次，蒲公英總黃酮提取率分別為7.96%、7.93%、8.01%，平均值為7.97%（RSD=50.73%），基本與預測值一致。重復性實驗證明，該工藝具有不錯的穩定性，與預測一致。

2.4 MIC和MBC值的測定結果

蒲公英總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的MIC值分別為8、32、64、64、128、64、128、8 mg/mL（表4）。從MIC值可以看出，蒲公英總黃酮提取物對金黃葡糖球菌和白色念珠菌具有較好的抑制活性，有很高的應用價值，對大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌等其他6種菌也有一定的抑制活性，但遜色于前二者，表現出明顯耐受性個體差異。

圖2 兩因素交互作用對總黃酮得率的響應面Fig.2 Response surface of interaction of two factors on yield of total flavonoids

表4 蒲公英總黃酮提取物對8種供試菌種MIC和MBC值Tab.4 Minimal inhibitory concentration and minimal bactericidal concentration of 8 tested strains against total flavonoid extract of Taraxacum

3 結論

該工藝在乙醇回流提取的基礎上增加浸泡環節，通過單因素和響應面方法優化蒲公英總黃酮的提取工藝，考察乙醇體積分數（A）、料液比（B）、浸泡時間（C）、回流時間（D）對提取工藝的影響。通過Box-Behnken試驗，得到最佳工藝：乙醇體積分數61.6%、料液比1∶38 g/mL、浸泡時間46 min、回流時間2.5 h，蒲公英總黃酮平均提取率為7.97%（RSD=50.73%）。

抑菌實驗表明：蒲公英總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、傷寒桿菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌8種測試菌均有抑制活性，MIC值分別為8、32、64、64、128、64、128、8 mg/mL。